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Western Blot 【实验原理】： Western Blot 印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF 膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经X 光片曝光、 显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。 Western blot 实验分为三个部分： 1． 样品蛋白质的制备、 蛋白质含量测定 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 3． 凝胶转膜及其检测 以提取细胞蛋白为例Western 印记杂交实验流程图： 提取细胞总蛋白、测定含量 ↓ 制备SDS胶 ↓ 蛋白样品变性、电泳 ↓ 电泳转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST 洗涤 ↓ HRP 标记的二抗 ↓ TBST 洗涤 ↓ ECL 试剂作用 ↓ X-光片曝光、显影 ↓ 结果分析 细胞总蛋白的提取及含量测定 一、细胞总蛋白的提取 提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很 多。其目的都是要获取高丰度、高品质的蛋白质,以满足实验需要。 在提取蛋白质实验中要特别考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度以及二价阳 离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白 酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的种类很多，如PMSF(苯甲基磺酰氟)；金属蛋白酶抑制剂乙二胺 四乙酸（EDTA）、乙二醇双四乙酸（EGTA）；肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽（leupeptin）、胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A）、抑蛋白酶肽（aprotinin）；甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）、 甲苯磺酰丙氨酰氯甲酮（TPCK）等，要根据具体情况具体选择。 制备蛋白质样品应遵循下述原则： 1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 2．细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋 白酶的降解。 3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。切勿反复冻融已制备好的样品。 （一）试剂 1．细胞总蛋白裂解缓冲液： 蛋白抽提试剂盒-I (实体组织和细胞蛋白抽提,) 2．PMSF 储存液(100mmol/L)： 称取PMSF 17.4mg，溶于1ml 异丙醇，分装后储存于 -20℃。 注意: PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不稳定，故应在临用前再加入到细胞裂解缓冲 液中， 使其终浓度为0.174mg/ml，如：1 ml 细胞裂解液中，加入10ul PMSF 储存液. （二） 仪器和耗材 冷冻离心机 无菌的Tip 头、1.5ml 及0.5ml 离心管 ， （三） 实验材料 Hela 细胞 （四） 实验步骤 1．细胞的预处理： 由37℃ CO2 培养箱中取出于60mm 细胞培养皿中培养的Hela 细胞，（细胞数约为5 ×106 ），吸弃原培养液，用4℃预冷的1×PBS 洗细胞表面3～4 次，以去除培养基中的血清 及死细胞，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。将洗涤后细胞直接冻存于-80℃冰箱，待 提取蛋白质。此方法可保存细胞至少两周。（注：如果需要，当用PBS 洗涤细胞后，不必-80℃冰箱冻存，可直接进行步骤2） 2．（由-80℃冰箱中取出细胞培养皿，将其置于冰上，） 向上述各培养皿中加100ul 含 PMSF 的蛋白提取液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。 3．冰浴40 分钟（通常冰浴时间为30～60 min），期间晃动3-4 次培养皿，使其作用均 匀。 4．用Tip 头集中蛋白提取液，将其收集入冰上预冷的1.5ml Ep 管中，4℃离心，12,000g × 20min。 5．将上清液小心移入预冷的0.5ml 离心管中（为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需 要将其分装使用），-80℃保存备用。 （五）操作注意事项 1．注意个人防护。PMSF 严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸 收有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗 2．所用离心机需提前预冷。 3．吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。 二、细胞总蛋白含量测定： 蛋白质的定量，目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、BCA法、Lowry法（Folin-酚试剂法）等。但各有优缺点，客户可以根据具体情况选取。 本实验仅以Bradford 方法为例。 ㈠ 试剂 1. 4mg/ml BSA 标准蛋白液：10μl/管，4℃保存。临用前， 加入70μl 生理盐水，配制成0.5mg/ml。 2. 5×Br