维生素D3和维生素E的测定.docVIP

维生素D3和维生素E的测定 测定参数　　维生素D3和维生素E 原理 HPLC 适用产品　　浓缩剂和预混料 测定范围　　　维生素D3　≥2000IU/g 维生素E　≥50IU/g 方法来源　　 Baker-10SPETM Application Guide Vol,1︰42 Cargill Notebook# 984︰40,41,46. 实验室联系人 姓名：Glenn Miller 公司：Cargill Lakeshore Laboratory 试剂（及适用来源） 乙酸，试剂纯。 乙腈，HPLC纯，Am.BJ或相当等级。 乙醇（无水）。 异丙醇，试剂级。 甲醇，HPLC纯，Am.BJ或相当等级。 二氯甲烷，HPLC纯，Am.BJ或相当等级。 BHT，分析纯，Chem Serv.Inc. 维生素D3标准品：试剂纯，U.S Biochemical Corp。 dl-α-生育酚乙酸酯（维生素E乙酸酯标准），试剂纯，U.S Biochemical Corp.Eastman Kodak Co.,or Sigma. dl-α-生育酚（维生素E乙醇标准），试剂级，U.S Biochemical Corp.Eastman Kodak Co.,或Sigma. 仪器设备（及适用来源） （1）高效液相色谱仪，Waters590型，双活塞泵，Waters Novapak 5umC18柱，带有20ul或50ul固定环管的进样阀。Kratos Spectraflow 783可变波长检测器，检测波长为260nm（测维生素D3）或292nm（测维生素E）或相同的HPLC系统。 （2）天平，称准到±0.0001g。 （3）水浴锅。 （4）氮气。 （5）250ml锥形瓶，带磨口接头和塞子。 （6）100、50、25、10ml容量瓶及各种移液管。 （7）Burrell旋转式振荡器。 （8）Vac-elut带减压多管装置的固体萃取器（分析化学公司生产或相当产品）。 （9）Baker S.P.E.C18固相萃取柱。 标准溶液 （1）1％乙酸溶液（去离子水配制）。 （2）1％乙酸溶液：异丙醇混合液（50︰50）。 （3）甲醇水溶液（80ml甲醇+20ml去离子水）。 （4）0.1％BHT（乙腈配制）。 （5）流动相：0.1％-4.0％甲醇水溶液，注意出峰的保留时间和分离度随水含量而改变，水含量愈高，保留时间愈长。 （6）维生素D3的标准贮备液：称25.0mg维生素D3结晶纯品置于50ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，然后放在试剂瓶中，充氮赶尽空气后盖紧，置冰箱避光处，保存期为一个月，每次使用前吸出部分，配置成工作标准液（参见注意事项（1））。 （7）维生素E乙酸酯标准贮务求认：准确称约100mgdl-α-生育酚乙酸酯到10ml容量瓶，用无水乙醇溶解并定容。用氮气赶尽空气后盖紧，贮于冰箱避光处。 维生素E乙醇标准液：准确称约500mg维生素E乙醇置于50ml容量瓶里，加无水乙醇溶解并定容。如同维生素D3标准液一样，贮于冰箱里避光处（参见注意事项（1））。 操作步骤 称10.0-20.0g样品放在250ml锥形瓶中，含维生素高的样品称样降至100.0mg，含维生素低的样品称样可多达25.0g。 取二个250ml锥形瓶中分别加入与样品所含维生素量相当的维生素D3和维生素E标准液。 在每个250ml锥形瓶中各加入50.0ml1％醋酸液。 为避光用铝箔将锥形瓶包扎隹，将氮气通入烧瓶30s赶尽空气后加盖，旋转混匀瓶中溶液。 将瓶放在沸水浴上反应5min，并定期旋转烧瓶。 冷至室温，在每个烧瓶中加入100.0ml异辛烷。 置振荡器上振摇2min，移开并静置1min以上。 将固相萃取柱装在减压多管装置上（先不放上收集管架）。加2ml甲醇预淋柱子，慢慢减压使甲醇液面降至填充层顶部时，加2ml1％乙酸溶液同样减压使液面降至填充层顶部（参见注意事项（2））。 分别吸一定量样品和标准加到各自的固相萃取柱上，一般根据维生素浓度吸0.5-2.0ml不等，样品液真空慢吸下降到吸附层顶部。 加1.0ml1％乙酸溶液：异丙醇混合液（50/50）、0.25ml甲醇水溶液（80/20）洗涤柱子，待最后洗涤溶液滴干后，继续减压抽1min，排空预淋液使柱子填充层干燥。 卸开减压多管装置，在柱子下面放上装有校准好体积为2.0ml收集管的管架，并对准每个标准和样品，再装好减压多管装置。 加0.5ml二氯甲烷到固相萃取柱上，并减压洗脱到收集管里以收集维生素。 再次加0.5ml二氯甲烷到柱上，继续减压直到全部二氯甲烷从萃取柱里排干。 卸下减压多管装置，在每根收集管里加0.1％的BHT乙腈液定容到2ml。 用滴管将收集试管中的洗脱定容液转移到自动进样小瓶里，贴好标签，密封置于避光处