生物化学及分子生物学实验考试幻灯片.docxVIP

一、 实验原理步骤： 1、 分子克隆总流程： 分子克隆：在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 流程： （1）带有目的基因的DNA片段的获得——PCR引物设计，PCR获得。 （2）重组DNA分子的构建——与载体酶切连接。 （3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选——转化，培养，筛选 （4）检测——菌落PCR检测，粗提质粒检测，酶切检测，精提质粒，测序。 2、质粒DNA的提取及鉴定——碱裂解法 原理： 根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 ? 在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。 ? 当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。 步骤：1、细菌培养和收集 ① 将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。（已完成） ② 取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中, 10000rpm离心1min，吸去培养液。 2、细菌裂解及质粒的提取 ③ 将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。 ④ 加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀内容物,将离心管放冰上5min。 ⑤ 加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置10min。 ⑥ 12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。 3、质 粒 的 纯 化 ⑦ 向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1) （注意下层是有机相）,反复混匀。 ⑧ 12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另一离心管（标记！）中 ⑨ 加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇 (24:1),反复混匀。 ⑩ 12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管中。 4、质粒的浓缩 ① 加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10-15min。 ② 12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 ③ 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀, 振荡并离心, 12000rpm离心2分钟，倒去上清液, 空气中干燥5－10min。 5、质粒的溶解和保存及电泳检测 ④ 加20ul TE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。 ⑤ -20℃保存 ⑥ 1%胶，恒压150V,电泳10-20分钟 要点：载体定义：基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 类型：大肠杆菌中的质粒、?噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。 条件：复制子、咸志梅单一识别位点、标记基因、适合的拷贝数 ? 碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同） ? 苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布） ? CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同） ? SDS 裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清） ? 玻璃纤维膜法(试剂盒) EDTA螯合Mg离子，抑制DNA酶活性， 3、质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测 原理：DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。 在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。超螺旋 》线型》 开环 步骤：1、酶切： 无菌ddH2O 4 μl 1 10xbuffer O 1 μl 2 质粒DNA 3 μl 3 BamHI 1 μl 4 NotI 1 μl 5 ———————————————— 总体积 10 ul 混匀后,点动（Short）离心， 37℃酶切60分钟 2、制胶1%，上样，电泳 4、目的基因片段的回收——玻璃纤维柱法 原理：利用特殊硅基质材料，在一定高盐（消除