有机磷降解酶在烟草中的高效表达幻灯片.pptVIP

有机磷降解酶在烟草中的表达 有机磷化合物 有机磷化合物在农业生产中作为杀虫剂被广泛使用，长期以来，有机磷农药使用量大、影响范围广、极易造成大面积污染，因而带来了环境问题： 一是污染大气、水环境，造成土壤板结 二是增强病菌、害虫对农药的抗药性 三是杀伤有益生物 四是农药对人体健康造成危害 有机磷降解酶 有机磷降解酶ophc2，主要来源于来源于假产碱假单胞菌等微生物。是目前公认的能有效降解有机磷化合物的手段，尤其是对有机磷农药残留等造成的污染的改善。 因此，利用基因工程方法，将ophc2在植物中表达，具有很大的应用前景 植物转基因技术的一般步骤 ⒈ 目的基因的获取 ⒉ 表达载体的构建 ⒊ 目的基因的转化 ⒋ 筛选阳性克隆 ⒌ 植株再生 有机磷降解酶基因的获取 将来源于假产碱假单胞菌的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定，根据得到的氧基酸序列设计合成了简并引物，通过PCR和反向PCR从中克隆出有机磷降解酶基因ophc2．编码基因全长975bp 引物：Primer—F (5TACGTAACCATGGCCGCACCGGCA—CAACAGAAG一3’) Primer—R (5’GAGCTCATCAGCGCTCGC—TACGGATCGG 3’) 表达载体的构建 将目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中，包括： 保存用中间载体：pBR322、pUC 繁殖载体： JM109, TOP10 植物转化载体（农杆菌寄主）： pBI121等 Ophc2基因表达载体的构建 将ophc2基因片段克隆到pGEM-T Easy载体上，测序正确后 ，用SnaBI和SacI消化得到目的片段，连接到含有extensin序列的 T easy-E／GFP载体上，命名为pTeasy-ophc2，extensin可帮助蛋白表达到胞外。用SacI和 XbaI从 pTeasy-ophc2上切下连接了extensin基 因序列的 ophc2，连接到 pBI121上获得 ophc2最终表达框，包含 CaMV 35S启动子序列、extensin序列、ophc2基因和nos终止子序列，命名为 pBI-E-ophc2，转化大肠杆菌JM109。 目的基因的农杆菌转化 从 E．coli JM109中大量提取质粒 pBI—E— ophc2的 DNA，电击法转化 Agrobacterium LBA 4404，菌落 PCR鉴定阳性克隆，叶盘法转化烟草 转基因植株的PCR检测 以转基因植株叶片所提取的总 DNA为模板，进行 PCR扩增，得到约 1 kb的特异性扩增条带，而野生型植株 中未产生该片段 。证 明 ophc2整合到基因组中。在 101株转化植株中，有 80株 PCR检测呈阳性 Western杂交检测 从 80株 PCR检测阳性的转基因植株中随机 挑选 60株提取植株的总蛋白，western杂交，结果有 24株植株呈阳性，初步证实该基因已在植物中得到表达 Ophc2酶活性检测 在胞外表达信号肽的引导下，该基因蛋白产物应分泌到胞外，因此在培养转基因植物的液体培养基中会存在OPHC2，取液体培养基浓缩后作为酶液，以甲基对硫磷为底物测定酶活性，可证实该外源基因的成功表达 讨论 转基因植物的潜在危害 其他转基因植物的研究 * * * 有机磷农药 有机磷农药造成水污染 有机磷农药中毒 土壤板结 分离基因 克隆到某中间载体 转化大肠杆菌 提取质粒 限制酶切/连接 克隆到植物表达载体 转化农杆菌 基因枪转化 pGEM-T JM109 pBI121 LBA4404, EHA 农杆菌: used extensively for genetic engineering of plants. 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组. Tumor induced by A. tumefaciens Ti Plasmid T-DNA region Left border Right border vir genes ori 已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。 auxin 农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 分化生芽 生根 叶盘转化法 (1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。