第七章酶联免疫吸附试验讲述.ppt

第七章 酶免疫技术 医学技术系检验教研室段慧英 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素等标记已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 2.分类： 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶标记技术 发光免疫技术 金标免疫技术 酶免疫技术概述 1、概念 以酶作为标记物标记试剂抗原或试剂抗体，抗原抗体反应后，通过检测酶促反应产物，以检测相应抗体或抗原的分析方法。 酶免疫技术概述2、分类 酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 （ELISA） 液相酶免疫测定 酶免疫技术概述 3、酶免疫测定的特点 几乎所有的可溶性抗原系统均可以检测 酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，它的最小可测定值达ng甚至pg水平 标记试剂比较稳定，且无放射性危害 操作简便，可进行大批量标本的测定，自动化程度高 既可定性测定又可定量测定 酶免疫技术概述 4、应用 广泛应用于免疫相关性疾病的诊断 微量蛋白质检测 酶和同工酶检测 肿瘤标志物检测 激素（肽类和非肽类）检测 药物和毒物检测 第一节 概 述 一、常用的酶及其底物： （一）酶选择的要求 ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得 （二）常用的酶和底物 1.辣根过氧化物酶（HRP）和底物 （1)来源: HRP在蔬菜作物辣根中含量很 高，纯化方法也不复杂。 （2）催化反应 : D2 H+H2 O2 — D+ 2H2O D2 H为色素原，D为色素。 （3）底物 : 四甲基联苯胺（TMB）、邻苯二胺（OPD）等。 TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸终止反应后变黄色，可在比色计中定量。(450nm) OPD灵敏度高，比色方便，其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。 2. 碱性磷酸酶（ALP）和底物 （1)来源 大肠杆菌提取，最适PH为8.0； 牛肠粘膜提取，最适PH为9.6。 （2）催化反应及底物 对硝基苯磷酸酯 +H2O—对硝基酚 +磷酸 (405nm) ALP系统敏感性高于HRP系统，空白值也低。但由于ALP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均采用HRP。 2、酶标记抗体（抗原)的方法 （1）改良过碘酸钠标记法 本法只适用于HRP的交联。 （2）戊二醛交联法 戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与抗体或抗原的氨基通过它而偶联 三、酶标记物的纯化及鉴定 第二节 酶联免疫吸附试验 ——ELISA 一、基本原理 将抗体（抗原）包被在固相载体上，加入待测抗原（抗体）和酶标抗体（抗原），待反应后充分洗涤，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量。 二、技术类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物。 （一）双抗体夹心法 1.概念 用同一种抗体分别作为酶标抗体和固相抗体以检测抗原的方法 2.应用：检测抗原最常用的方法 3.原理 4、特点： 非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 5.操作步骤 1） 包被抗体 。将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 （二）双位点一步法 1.概念 用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，以检测抗原 2.应用 检测抗原，较双抗体夹心法更为简便省时 （三）竞争法 1.概念 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比