园艺植物生物技术 第六章 基因分离与克隆2.pdf

第二节 基因克隆操作 ? 意义 ? 基因克隆常用工具 ? PCR ? 基因文库构建 ? 基因的筛选与鉴定 一、基因分离的意义 ? 特有基因：生物进化，木本果树与草本植物不 同，更复杂；目的不同，果树以生产果实为目 的；多年生，控制更复杂，影响因素也更多。 ? 通过分离的基因，对生理现象遗传控制的分子 机理进行研究，这是无法以拟南芥代替的。例 如，果树童期分子机理的研究。 ? 互相促进，相辅相承。 2. 基因分离 的工具 就像在一堆稻草里寻 找一根针一样，一段 特殊DNA序列的分离 过程十分困难。一般 都需要在大肠杆菌扩 增与表达。 1973年Cohen完成第一个基因操作实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌 ?所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞 二、基因分离常用工具 ? ①限制性内切核酸酶 ? ②连接酶 ? ③聚合酶 ? ④载体 ? ⑤受体细胞 限制性内切酶的特点 1、有特定的识别序列，通常为4－6个碱基的回 文对称序列。 2、切割位点位于识别序列内的固定位置上，切 割后在5’末端有磷酸基团，3’末端有羟基。 3、切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3' 突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)两种 4、其活性发挥只需Mg2＋作辅酶。 EcoR I: 5’ -- NG 3’ 5’ AATTCN -- 3’ 3’ -- NCTTAA 5’ 3’ GN -- 5’ BamH I: 5’--NG 3’ 5’GATCCN--3’ 3’--NCCTAG 5’ 3’ GN--5’ EcoRV 5’ --NGATATCN--3’ 3’ --NCTATAGN--5’ 5’--NGAT 3’ 5’ ATCN--3’ 3’--NCTA 5’ 3’ TAGN5--’ 5’--NGGATCCN--3’ 3’--NCCTAGGN--5’ 5’ --NGAATTCN--3’ 3’ --NCTTAAGN--5’ ②连接酶 体外催化磷酸二酯键的形成可使用两 种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶， 但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都 是首选的酶，因其能在正常的反应条件下 能有效的将平端连接起来。 各种连接酶特性的比较： T4DNA Ligase E.coli DNA Ligase T4 RNA Ligase Ligases of thermophilic bacteria 最适pH 辅酶 7.2-7.8 ATP 7.5-8.0 NAD 7.2-8.4 ATP NAD 平滑末端 可能 * 不能 NO DNA 5’P末端和 RNA 3’OH末端 可能 可能 不能 NO RNA 5’P末端和 DNA3 ’OH末端 可能 不能 不能 NO RNA和RNA 少数 可能 不能 可能 NO ③聚合酶 ? 催化DNA的合成 ? E.coli DNA聚合酶I: 聚合和外切活性 用来切口平移标记，末端标记 ? Klenow DNA聚合酶：补平3’凹端，抹平3’凸 端，随机引物标记。 ? 耐热DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶，Vent DNA聚 合酶，pfuDNA聚合酶。 ? 反转录酶：AMV, MMuLV ? T4/T7噬菌体DNA聚合酶 载体必备条件： 1. 含有复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖， 其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大 量扩增； 2. 有1到几个限制内切酶的单一识别与切割位 点，便于外源基因的插入； 3. 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记 等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据 此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来。 ④ 克隆载体 载体类型 ? A. 质粒载体 ? B. 噬菌体载体 ? C. 粘粒载体 ? D. BAC/YAC载体 ? E. 其他 l质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子，具 有自主复制和转录能力 l是双链闭合环状DNA分子 l大小在1－20kb之间 l它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染 色体上。 质粒的基本特点 质 粒 pCAMBIA1301和pCAMBIA1391的区别 ？ 标记基因 ? 抗生素基因：四环素抗性基因 Tetracycline 氯霉素抗性基因Chloramphenical 卡那霉素抗性 Kanamycin 新霉素抗性 Neomycin 氨苄青霉素