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标记免疫技术 医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO四年三月 标记免疫技术= 免疫技术+标记技术 标记免疫技术 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光技术 金免疫技术 ??? 第八章 放射免疫技术 类型： 放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric assay,IRMA） 广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。 特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、 重复性好等 标记物: 常用的核素有两大类 γ射线： 131I、125I、57Cr和60Co β射线：14C、3H和32P。 使用最广泛的是：125I ①性质活泼、易制备标记物 ②对被标记物的免疫活性影响小 ③测量方法简便、已推广 ④半衰期较长、核素丰度高 标记方法 125I的标记 原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基及组胺残基上的氢原子 方法： 直接标记法 氯胺T法和乳过氧化物酶法 间接标记法 联接标记法 适用分子 原理 特点 缺点 直接标记 肽类、蛋白质、酶 存在酪氨酸、组胺残基等基团 操作简便、易标记、比放射性高 不适于活性功能区的残基标记 间接标记 甾类化合物、核苷酸等小分子化合物 不存在酪氨酸、组胺残基等基团,需添加 可避免氧化／还原剂对被标记物活性的损伤等 添加基团可能影响被标记物活性 标记物纯化 对游离的125I等试剂与标记物进行分离 方法：分子筛凝胶过滤；离子交换层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）；高效液相色谱（HPLC） 标记物鉴定 放射化学纯度 单位标记物中结合在被标记物上的放射性占总放射性的百分率。一般要求大于95％。 免疫活性 标记过程中，被标记物活性损伤程度。B/T％80％， B/T％ ↑ 抗原损伤↓。 比放射性 单位化学量标记物中所含的放射性强度. 常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。 比放射性↑ 方法更灵敏；过高 辐射自损伤大，对标记物免疫活性影响大，储存稳定性差 。 抗血清鉴定 多克隆抗体的抗血清是放射免疫分析的主要试剂之一，其质量直接影响方法的特异性和灵敏度。 亲合力 选用亲和常数K值大(109~1012 L//mol)抗血清 特异性 其程度可直接影响结果的准确性 滴度 最大稀释度。在本技术方法中是指结合50％标记抗原时的抗血清的稀释度。 放射免疫分析（ RIA ） 基本原理 采用定量的标记抗原（Ag＋）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。 以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F与Ag的量变存在着函数关系。 测定方法与步骤 1.抗原抗体反应：平衡法或非平衡法 2.分离结合与游离标记物 沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻底，迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作简便，重复性好且经济。 3.放射性测定及数据处理 晶体闪烁计数仪(γ射线)或液体闪烁计数仪( β射线) 绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。 免疫放射分析（IRMA） 基本原理 单位点IRMA： 利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。 双位点IRMA 先用固相抗体与抗原反应结合,然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标记抗体,测定固相上的放射性。 IRMA与RIA的异同点 标记物 在RIA中 核素标记抗原，抗原有不同种类，根据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中 核素标记抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标记，不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了分析的灵敏度。 反应速率 反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单克隆体也能得到满意的结果。 反应原理 RIA为竞争抑