第5章基因工程基本流程-获取目的基因教程范本.pptVIP

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2017-04-19 发布于湖北
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第5章基因工程基本流程——获取目的基因;;;鸟枪法（shotgun?）;;鸟枪法基本程序;;;;; 例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将重组子用SalI切开，凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0kb大小区域内的凝胶块，回收DNA片段，根据目的基因内部的特征性酶重复酶切过程直至筛选成功;; 鸟枪法操作的改进-非随机鸟枪法;鸟枪法的局限性;cDNA法;;;;核酸酶S1;;2）cDNA第二链合成-置换合成;;;;;双链cDNA的克隆;cDNA重组克隆的筛选;;;;原理：;;A;PCR扩增法;1. 直接从基因组中扩增;原核基因组部分;（1）提取基因组 total RNA;;化学合成法;;固相磷酸三酯合成过程;;;;;;;;;;;;; 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。根据构建方法的不同，基因文库分为: 基因组DNA文库（genomic DNA library, 含有全部基因） cDNA文库（complementary DNA library, 含有全部蛋白质编码的结构基因） ; 基因组文库的大小;;cDNA文库的大小;例如：人的成纤维细胞中，每个细胞内不到14个拷贝的低丰度mRNA约占整个mRNA含量的30%，这种mRNA大约11000种，因此 ; 文库的质量标准;制备原则：DNA片段之间存在部分重叠、大小均一;②常用载体 ;（3）构建基因文库的受体选用;;基因组文库重组克隆排序;;基因文库的筛选;文库的保存