蛋白质的分离纯化与定性定量分析综述.ppt

蛋白质的分离纯化与定性定量分析;什么是蛋白质的分离纯化;为什么要纯化蛋白质？;怎样纯化蛋白质？;蛋白质纯化的基本设计原则;蛋白质的检测方法;分离纯化的一般程序;相对离心力/×g;粗分级分离（rough fractionation） 获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与其它杂蛋白分离开来。 常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等 特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。;细分级分离（fine fractionation） 主要方法： 层析：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等 ;1. 蛋白质的层析分离;层析（chromatography）;固定相：固定相是层析的基质。通常是固体（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 ;按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用； 柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。;怎样纯化蛋白质？;1. 离子交换层析;Ion-Exchange chromatography;Increased salt concentration;基本操作过程;离子交换层析有两种洗脱方式;分步洗脱;梯度洗脱;2. 凝胶过滤层析;Size-exclusion chromatography;Size-exclusion chromatography;要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过滤基质； 凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”； 凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息； 凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1～5％； 凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过100mg/ml。 ;3. 亲和层析;Affinity chromatography;Commonly used affinity columns: Ni2+ ? binds to poly Histines (example 6xHis) Specific antibodies (anti-Flag tag) glutathione ? binds to GST Protein A or G ? binds antibodies;Possible elution strategies: pH Ion strengh Denature Competitor ligand or analog ;Ni-NTA columns;2- the specificity of the interaction between histidine residues and immobilized nickel ions;在各种表达载体上都带有各种标签蛋白，如GST-tag、His-tag、V5-tag等，它们不仅可用于鉴定蛋白表达与否，更可用于与之相连的目标蛋白的纯化； 通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带有标签的目标蛋白。;高效与简便：一旦固定化配体制备好后，操作使用非常方便； 亲和层析是高度浓缩的过程； 可从样品中去除大量杂质； 可在活性物质中去除理化性质几乎完全相同的但已失活的那些“杂质”。;免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲和柱可用于抗原蛋白的纯化； 凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性和糖类和糖复合物结合的蛋白质，固定化凝集素可用于糖蛋白纯化； 染料亲和层析：有多种染料可与各种类型的酶结合，又不受酶的作用，可用于多种蛋白的分离。;4. 疏水层析与反向层析;反向层析，或称反相色谱，reverse phase chromatography，是液相色谱分析中最常用的技术。 当反相色谱用于蛋白质分离时，其原理与疏水层析基本相同，区别在于： 疏水层析的配基疏水性较弱（苯基等），所以高盐吸附，低盐洗脱； 反相色谱配基疏水性强（C18等），所以需要使用有机溶剂洗脱。;反相色谱分离蛋白质的原理;反相色谱是最高效的蛋白质层析技术之一;2. 蛋白质的电泳分离;电泳（electrophoresis）;