5.3血红蛋白的提取和分离 同步训练 人教版选修一.docVIP

PAGE  5.3血红蛋白的提取和分离 同步训练 人教版选修一 知识点一　分离蛋白质的基本方法原理 1．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是(　　) ①相对分子质量最大的　②相对分子质量最小的 ③相对分子质量适中的 A．①②③ B．③②① C．①③② D．②①③ 2．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须(　　) A．具有相同的相对分子质量 B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子 C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子 D．具有不同的相对分子质量 知识点二　分离蛋白质的实验操作 3．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是(　　) A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐 B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面 C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱 D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液 4．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析无误的是(　　) A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果 C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水 D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 答案 1．C　分子很大，完全不能进入凝胶内的任何孔隙的蛋白质洗脱出来的时间最短；分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分的蛋白质，洗脱出来的时间次之；分子很小，能进入分子筛全部孔隙内的蛋白质，洗脱出来的时间最长。 联想　凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，相对分子质量很小，能进入分子筛的全部孔隙，运动速度最慢，路程最长；相对分子质量较大的，不能进入凝胶颗粒内，运动速度最快，路程最短。所以，蛋白质可以按不同顺序洗脱出来。 规律链接　凝胶色谱中分子彼此间较易分开的原因 在凝胶色谱中会有三种情况：一是分子很小，能进入分子筛的全部内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。三类分子彼此间较易分开。 2．C　若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。 3．C　打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，在用同样的方法小心加入适量的20 mmol/L的磷酸缓冲液，然后连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱。 规律链接　血红蛋白提取与分离过程中的注意事项 1．红细胞的洗涤 (1)离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。 (2)重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。 2．血红蛋白的释放 (1)蒸馏水的作用：使红细胞的细胞膜和核膜破裂。 (2)甲苯的作用：溶解细胞膜。 3．色谱柱填料的处理 为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2 h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。 4．凝胶色谱柱的装填 在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 (1)在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 (2)在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。 5．蛋白质的分离 滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。 4．D　洗涤红细胞的目的是去除血浆中除血红蛋白以外的杂蛋白；洗涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的生理盐水。