分子条形码常见问题解答.pdf

问答 — 前言 什么是 NGS？ 新一代测序 (NGS)、大规模平行测序和高通量测序是描述可同时对数百万 DNA 小片段进行测序的创新 DNA 测序技术的相关术语。与标准 Sanger 测序法相比， 这一现代化技术得到的结果将大幅增加被测序碱基对的数量。 NGS 已广泛应用于众多领域，其中最常用的是基因组 DNA 变异分析和 RNA 表达 分析。这些分析应用可以扩展到整个基因组（WGS 或全基因组测序）和整个外 显子组（WES 或全外显子组测序），还可专门测序特定区域和基因组合。 WGS 可捕获所有可能的突变，而 WES（尤其是靶向测序）的优势在于在维持原 有经济效益与数据解析复杂程度的同时获得较高的目标区域覆盖率。极高的测 序覆盖率对于发现出现比例较低的癌症突变至关重要 (1)。 如何在 NGS 前富集靶标区域？ 在 NGS 前，有几种方法可以富集目标区域，最常用的两种方法是：1) 使用靶 标特异性探针从测序文库中进行杂交捕获；2) 利用靶标特异性引物直接用样品 DNA 进行 PCR 扩增 (2, 3)。 使用杂交捕获方法时，将 DNA 片段在溶液中与基因组中靶标区域对应的序列特 异性捕获探针进行杂交。典型的杂交捕获技术包括 Agilent SureSelect、NimbleGen SeqCap 和 Illumina TruSeq (4)。 在扩增子测序中，在 NGS 前使用一组选定的外显子引物通过 PCR 富集靶标基 因。典型的扩增子捕获技术包括 Ion Torrent AmpliSeq、RainDance ThunderBolts 或 Illumina TruSeq 扩增子等仅基于 PCR 的方法，以及 Agilent HaloPlexHS 等杂交和延 伸方法 (5)。 分子条形码 — 常见问题解答利用 HaloPlexHS 检测低频等位基因变异 作者 Anniek De Witte1、Katie L. Zobeck1、 Linus Forsmark1、Christian LeCocq1、 Heather Tao1、Bahram Arezi2 和 Magnus Isaksson1 1安捷伦科技有限公司，美国加利福 尼亚州圣克拉拉市 2安捷伦科技有限公司，美国加利福 尼亚州拉霍亚 2NGS 中潜在的错误来源有哪些？ NGS 和靶向序列捕获技术的进步使 其可用于测定异质混合物中的低频突 变。然而，PCR 和测序方法的系统误 差使 NGS 的进一步发展受到了限制。 文库制备、靶向序列捕获和测序均采 用 DNA 聚合酶以及扩增步骤。这些 过程会引入偏差，包括重复、相应的 不均匀扩增以及因聚合酶误差导致的 假象，这种误差会引入原始样品中本 不存在的序列变化 (1)。以最常使用的 Illumina 测序仪来说，误差率在 ~0.05% 到 ~1% 之间，具体取决于读取长度、 所用的碱基识别算法和测定的变异类 型 (6)。使用分子条形码可使结果更加 可靠，对突变率和误差率在同一数量 级的临床样品更有帮助。 问答 — 分子条形码 什么是分子条形码？ 分子条形码方法是为同一样品的每个 原始 DNA 片段连接上一段独一无二的 序列编码。分子条形码通常设计为完 全随机的核苷酸链（如 NNNNNNN）、 部分简并核苷酸链（如 NNNRNYN） 或指定核苷酸链（模板分子有限 时）。分子条形码可用于计量高覆盖率 NGS 数据中的测序误差和 PCR 误差。 分子条形码和样品条形码有何 不同？ 样品条形码和分子条形码通常同时存 在于同一测序读出序列中。分子条形 码可用来减少假阳性结果，而样品条 形码也称为标签接头，常用于多数当 前的 NGS 流程中，允许在测序前对样 品进行混合。样品条形码扮演着标识 符或标签的作用，以确定读出序列来 源于哪个样品，因此可以在一次运行 片段末端，影响追踪不同起始分子以 及去除 PCR 重复和相关扩增假阳性的 能力。 请介绍一下分子条形码技术的 历史 自 2007 年开始，陆续有报道指出可 用分子条形码标记单个模板来解决 NGS 中的 PCR 重复和扩增误差问题。 过去，分子条形码或分子标记被称 为唯一标识符 (UID)、唯一分子标识 符 (UMI)、引物 ID 或双条形码等多个 名称。 可采用多种不同的技术将分子条形码 添加到模板上。其中一种方法是在基 因组测序的文库构建步骤中将分子条 形码整合到测序接头上。这种“双测 序”方法可以有效减少对 DNA 双链中 任意一条链单独标记和测序时造成的 误差 (8)。另一种方法是将条形码结合 到分子倒置探针上以进行靶标体细胞 突变检测。通过 smMIP（单分子倒置 探针）将单分子标记与多重靶向捕获 结合，从而对低频变异等位基因进行 有效的高灵敏度检测 (9)