DNA重组和鉴定.ppt

DNA重组技术第十四讲 主讲教师：刘湘帆;DNA重组技术;DNA重组技术： 按照人的意愿在体外对 DNA 分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞 中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。;重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获得和载体的选择2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化;;3`5`磷酸二酯键;T4DNA连接酶：ATP是辅助因子； 大肠杆菌DNA连接酶NAD+是辅助因子。;;;DNA Ligase;克隆载体具备的特征：;;（一）DNA重组的方法1、分类： 粘端连接法  平端连接法 依据外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶酶切位点的性质来做选择。;;◇同源粘性末端：相同一种内切酶产生的粘性末端或不同的内切酶产生的互补粘性末端。◇特点：得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点，原切割内切酶，重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。;kpnI;;自身环化;如何提高连接的效率，防止假阳性的产生？;缺口;  1）一定数量的载体自身环化分子，产生较高的假阳性在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体的5’磷酸以抑制质粒DNA的自身环化。2）用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA，连接时插入片段可以两个方向插入载体中。3）片段的多拷贝插入 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：载体摩尔数为3：1 ;; （1）限制性内切酶酶切获得的是平齐末端；或者外源DNA片段和载体是两个不相配的DNA片段；（2）用末端转移酶使其中的一个DNA分子3’端上接上多聚A,另一个DNA片段3’端上接上多聚T。（3）使两个DNA分子的尾部可按A-T配对原则相联 （4）DNA聚合酶填补空隙（5）DNA连接酶封口成重组DNA分子 ;;;（1）目的基因或DNA片段的两端接上能够被某一  限制性内切酶识别的DNA序列（接头）（2）在该内切酶的酶解作用下，与载体获得 相同的粘性末端（3）连接 ;;;（二）重组DNA分子转入宿主细胞;宿主细胞  原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞 ;;;;;细菌; [关键点]： 细菌必须处于生长对数期 实验操作必须在低温下 设立已知质粒载体的阳性对照 不加任何质粒的空白感受态细菌阴性对照 ;;[原理] 利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。;;;;（1）CaCl2处理以后的转染： 真核细胞一定要经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol/L）溶液处理以后成为感受态细胞，感受态细胞有摄取各种外源DNA的能力。（2）电击法：利用脉冲电场将DNA导入受体细胞。（3）聚乙二醇介导的转染法：用于转染酵母细胞以及其他真菌细胞。细胞用消化细胞壁的酶处理以后变成球形体，在适当浓度的PEG 6000的介导下，将外源DNA导入受体细胞。;（4）磷酸钙-DNA共沉淀法：将被转染的DNA和正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，磷酸钙和外源性DNA形成沉淀颗粒附着在细胞表面，通过细胞脂相收缩时裂开的空隙进入或在钙、磷的诱导下被细胞摄取，通过内吞作用进入受体细胞。（5）二乙胺乙基（diethyl-aminoethyl, DEAE） -葡聚糖介导的转染：可能是DEAE-葡聚糖与DNA结合后抑制核酸酶的作用或与细胞结合后促进细胞对DNA的内吞作用。;（6）原生质体融合： 外源性DNA片段与噬菌体DNA载体连接后成为重组噬菌体DNA，经噬菌体外壳蛋白包装完毕以后，成为有感染能力的噬菌体颗粒。（7）脂质体法（liposomes） ： 带正电荷的N-[1-（2，3-二油酰氧）丙基]-N，N，N-三甲铵硫酸二甲酯和二油酰磷脂酰乙胺，与DNA或RNA上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子脂质包裹DNA的颗粒，随后脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过二者的融合将外源基因导入细胞。（8）细胞核的显微注射法：;磷酸钙与DNA形成共沉淀，附着细胞表面;;;;重组子的筛选和鉴定;（一）根据载体的性状变化进行筛选;;  当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未