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AFLP技术 1 导论 扩增酶切片段多态性（Amplified Restriction fragment polymorphism，AFLP）是由Zabeau等（1992）发明，并于1993年获得欧洲专利，该专利的专利权现在由荷兰Keygene公司拥有；被誉为新一代的分子标记技术。 AFLP实质上是RFLP和RAPD的的结合和发展，它继承了RFLP的可靠性和RAPD的方便敏捷。AFLP只需要极少量的DNA材料，不需要Sourthern杂交，不需要预先知道DNA的顺序信息，实验结果可以提供大量稳定可靠的信息。同时，AFLP产物是典型的孟德尔方式遗传。 AFLP的基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。首先用限制性酶产生基因组DNA酶切片段，然后使用双链接头与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由三部分组成：①核心碱基序列，该序列与人工接头互补；②限制性内切酶识别序列；③引物3’端的选择碱基。选择碱基延伸到酶切片段区，这样只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。扩增片段通过变性聚丙烯酰胺电泳分离检测。被扩增的DNA限制性酶切片段由二个限制性内切酶产生，一个为酶切位点较少的限制性酶（如EcoR I），另一个为多酶切位点的限制酶（如Mse I）。所以，AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段。采用双酶切的原由是：①多位点酶切产生小的DNA片段，这些片段易被扩增且片段长短适宜在变性胶上分离；②切点数少的酶可减少扩增片段的数目。由于扩增片段是由多切点酶和切点数较少的酶酶切后产生酶切片段，这样就可选择扩增时所需的选择碱基数目限制在一定的范围内；③利用双酶切使对PCR产物的单链进行标记成为可能，从而防止胶上由于扩增片段双链迁移率不一致而造成的双带现象（doublets）；④双酶切可以对扩增片段的数目进行使活调节；⑤通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的AFLP指纹。AFLP技术包括三个主要内容：①模板的制备；②片段的扩增；③聚丙烯酰胺变性胶电泳分离检测。 引物的设计对AFLP的成功与至关重要。引物的设计主要取决于人工接头的设计，接头为双链的寡核苷酸，其设计遵循随机引物的设计原则，应避免自身配对并具有合适的G、C含量。人工接头未进行磷酸化处理，所以只有一条单链被连接在酶切片段末端。Vos等发现扩增结果较好的引物都具有5’端以G碱基开始的特点，以有效地防止双链的形成，同时他们还发现引物3’端寡核苷酸的掺入受dNTP浓度的影响，无论5’端使何种碱基，dNTP浓度过低时双链结构容易产生。对于双酶切反应来说，引物的组合数共有（2n）2种（n为选择碱基的数目）。引物选择碱基的数目一般不超过三个，当引物具有一个或二个选择碱基时，引物的特异选择性较好，选择碱基增加到三个时，引物的选择特异性仍然不错，但随着引物选择碱基的增加，引物与模板的错配频率相应增加，扩增的特异性发生下降。在利用AFLP技术分析较为复杂的基因组时，扩增反应分为两个步骤，先用单选择碱基引物进行扩增，然后再利用多个选择碱基（如3个）的引物进行扩增，这样既可以提高指纹图谱的清晰度，亦可减少非特异性扩增的发生。 2 试验条件 【药品试剂】 5×RL+-Buffer： 50mM Tris·Hac（pH 7.5） 50mM Mg (Ac)2 250mM KAc 25mM DTT 250ng/(l BSA EcoR I（Pharmacia） Mse I（N. E. biolabs） Mse I接头 EcoR I接头 10mM ATP T4 DNA连接酶 (32P-ATP T4-Kinase（T4激酶，Pharmacia，10 Unit/(l） 10×T4-buffer： 250mM Tris·HCl （pH 7.5） 10mM MgCl2 50mM DTT 5mM亚精胺（3HCl-form） 10×PCR-buffer： 100mM Tris（pH 8.3） 15mM MgCl2 500mM KCl Taq 聚合酶 5mM dNTP TE0.1溶液： 10mM Tris·HCl（pH 8.0） 0.1mM EDTA 甲酰胺 EDTA（乙二胺四乙酸） 10%过硫酸铵 尿素 TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺） 丙烯酰胺 N,N’-甲叉双丙烯酰胺 溴酚兰 【仪器设备】 冰，4℃、37℃、70℃水浴 PCR反应仪 高压电泳仪 测序电泳槽 微量移液器 X光片 3 操作程序 1．基因组DNA的酶切 在下列反应中加入： 0.1~0.5(g DNA 5单位EcoR I（Pharmacia） 5单位Mse I（N. E. Biolabs） 8(l 5×RL＋-buffe