高效液相色谱25746幻灯片.pptVIP

高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography;第一节、概述 ;二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较;2. HPLC与GC的比较;按固定相的聚集状态分类： 液-固色谱法 液-液色谱法 按分离机制分类： 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法;其它分离机制色谱法： 亲合色谱法 AC 胶束色谱法 MC 手性色谱法 CC 毛细管电色谱法 CEC;类 型;极性增加;第二节 HPLC仪器;;;第二节 HPLC仪器;;1、贮液器和吸滤器：;2、高压输液泵;;活塞型往复泵 ——液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵 ;双活塞型往复泵;一、 高压输液系统;一、 高压输液系统;一、 高压输液系统;一、 高压输液系统;二、 进样系统;二、 进样系统;三、 色谱柱;四、 检测系统;石英窗;四、 检测系统;2、荧光检测器;3、蒸发光散射检测器;光源;接参比电极 和对电极;检测器;五 、 数据处理和计算机控制系统;1、要求： 粒径小、颗粒分布均匀 传质快、渗透压小 机械强度高、能耐高压 化学稳定性好;一、固定相;（2）按孔隙深度分 表面多孔型：实心玻璃珠为基体，基体表面覆盖一层多孔活性材料 适于常规分离分析 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成 适于复杂混合物的分离。;3. 常用固定相 液固色谱固定相 常用粒径3~10μm，理论塔板数过 5 万/米 无定形全多孔硅胶：YWG 球形全多孔硅胶：YQG 高分子多孔微球：YSG;3. 常用固定相 化学键合固定相 以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上;Si-O-R： 热不稳定、易水解，适于不含水或醇的流动相 Si-R(或Si-N)： 不水解，热稳定性较好。但格式反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。 Si-O-Si-R： 不水解，热稳定性好，pH2-8范围内对水稳定;3. 常用固定相 化学键合固定相 非极性键合相：十八烷基键合相（ODS，C18） 中等极性键合相：醚基键合相 极性键合相：氨基、氰基键合相;3. 常用固定相 其它固定相 离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子交换树脂 空间排阻色谱固定相：凝胶 手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精 亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体;二、流动相——淋洗液，洗脱剂;2、流动相组成;正相色谱：极性固定相——非极性流动相（加极性调节剂如氯仿）——极性柱（正相柱）;正相色谱;HPLC方法;第三节 HPLC方法及原理 ;一、液-液分配色谱法（LLPC）; ;1、反相键合相色谱法（RPBPC）; 分离机理——疏溶剂作用理论;分子中非极性部分——疏水烷基 ——缔合作用，分子保留 分子极性部分——极性流动相 ——离开固定相，减小保留;改变流动相配比可分离极性化合物 用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的样品有机酸、有机碱等。;固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面 流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等） 分离机理：范德华力、诱导力或氢键力 用途：多用于分离极性或中等极性化合物;3、离子键合相色谱法 ;分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同;原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别; ;固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。 ;凝胶过滤色谱： 以水或缓冲液作流动相 主要适合于水溶性高分子的分离 凝胶渗透色谱： 以有机溶剂作流动相 主要适合于脂溶性高分子的分离;七、亲和色谱法（AC） ;具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留；没有亲和力作用的分子不被保留。;第四节 HPLC分离条件的选择;（1）固定相： ①粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力； ②改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。;（2）流动相： 低粘度的流动相——增大组分 在溶剂中的扩散系数Dm——减少传质阻力 （3）流速： 最佳流速在流速很小处，减小流速有利提高柱效 常采用比最佳流速高数倍的流速——加快分析速度;（4）柱温： 提高柱温——降低流动相粘度——减少传质阻力——分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡， 一般在室温下进行;第五节 HPLC的建立与应用;;一、建立HPLC分析方法的一般步骤 ;一、建立HPLC分析方法的一般步骤 ;一、建立HPLC分析方法的一般步骤 ;二、HPLC定性定量分析方法;二、HPLC定性定量分析方法;1、在食品分析中的应用 食品营养成分分析：蛋白质、