生物工程下游技术第三章微载体培养技术幻灯片.pptVIP

第三章 微载体培养技术（microcarrier culture technique） ;最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。;1967年被用于动物细胞大规模培养。 兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。 现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。;二、微载体的商品类型;显微镜下的高密度微载体;优良的微载体应具有的特性;三、微载体培养原理与操作 ;●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。 ;细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。 ;Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化;通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。 ;搅拌速率越大，制得的微球越小，聚合物浓度越大，制得的微球较大; 3、细胞与微载体的相融性： 与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。 ;(a)MCC细胞，未经处理的Cytodex-3表面；(b)MCC细胞，用纤粘连蛋白处理后的Cytodex-3表面 (c)Vero细胞，未经处理的Cytodex-3表面； (d) Vero细胞，用层粘连蛋白处理的Cytodex-3表面(e) Vero细胞，用纤粘连蛋白处理的Cytodex-3表面; 4、细胞在微载体表面的生长 受影响因素： 细胞方面：细胞群体、状态和类型。 微载体方面：微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。 培养环境中：培养基组成、温度、pH、DO以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。 ;微载体系统培养细胞的步骤：;交联葡聚糖 纤维素为基质微载体 蛋白质为基质微载体（变性胶原微载体:蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合） 高分子材料为基质微载体 无机玻璃基质微载体 ;PCL微球表面多皱，PLLA微球表面布满坑洞，PGLA微球表面光滑;多孔载体培养;多孔载体制备的材料选择;5、微载体培养操作要点 ;贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。 ;●培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液（停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。 ; ●收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收集细胞及其产品。 ;●微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。 ;细胞形态饱满、生长良好;四、微载体培养优点 ;传统方法——疫苗生产的流感病毒在鸡胚内培养 生产过程：对几百万个蛋胚逐一接种和收获，很难自动化、劳动强度大、时间消耗多，且有污染的可能。;流感疫苗生产的大规模生产区域;Vero细胞流感疫苗生产图