荧光定量PCR原理和应用-LQ解决方案.ppt

December,2004 实时荧光定量PCR原理及应用 刘倩 公式推导: 相对定量——通过 内标基因定量 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小 内标数量代表样本中所含细胞或基因组数量 对样品量校正：目的基因数量/内标基因 内标通常选用beta-actin、GAPDH基因、18s rRNA 等看家基因 利用TaqMan技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异-双标准曲线法 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针 标准品（质粒）构造标准曲线 多重PCR反应 阴性对照 无RNA对照（空白） 无逆转录酶对照（监控基因组污染） 标准曲线 样品扩增：正常vs肿瘤 实验结果 实验结果 2-ΔΔc(t) 法 ΔΔC(t)=4.41-5.18 =-0.77±0.18 2-ΔΔc(t) =1.51－1.93 结果与双标准曲线法相近 定性分析： 点突变分析 等位基因型分析 DNA甲基化分析 SNP分析 熔解曲线分析 两条探针分别针对不同等位基因 SNP placed in the center of the probe Quencher; TAMRA or MGB/NFQ* 等位基因型分析的原理与点突变分析方法相同 SNP分析：SNPs，即单核苷酸多态性，这种人类最常见的可遗传变异占据了所有已知多态性的90%以上，因此作为研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，也因此国际人类基因研究学会花费大量的资金来完成人类单体型图谱。SNP分析从根本上来说其实就是确定一对染色体的每种基因的两个拷贝，哪种点突变在这两个拷贝中存在，因此利用定量PCR方法，并配合芯片技术可以快速灵敏的检测到SNP结果。ABI号称有数以千记的定量PCR试剂盒，自然在这方面也不会留下空白，TaqMan SNP Genotyping Assays包含了一百万的HapMap SNPs（人类单核苷酸多态性图谱SNPs），方便SNP分型高通量研究。 DNA甲基化分析：CG 岛内胞嘧啶的甲基化形成 5’-甲基胞嘧啶被认为和许多人类疾病特别是癌症有关。Laird 等人利用一种被称作 Methylight 的技术。 Methylight 是一种基于 Taqman 探针的甲基化特异定量 PCR 技术。在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。特异的引物和 Taqman 探针被用来区分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它实时 PCR 方法一样，Methylight无需电泳，因而提高了反应的灵敏性和通量。这种方法的灵敏性在食道癌病人血液中癌细胞异常甲基化的DNA检测中被证明。 样品 DNA纯度：OD260/OD280=1.8 DNA用量：0.05 ng –100 ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：10-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL 如何判断所得到数据的好坏 关于扩增曲线，经验总结认为：“1. 总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。2. 曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。 3. 基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。4. 曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。5. 低浓度曲线指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵敏度高。” F R F Q G V Q T C SNP G/A F Q G V Q T Forward primer Reverse primer Allele-specific probe Allele-specific probe 点突变分析—双Taqman探针法 实验2 wt mut G C C T 点突变分析—双Taqman探针法 实验2 T G A A 双Taqman探针法检测野生型和突变型 杂合体个体的DNA扩增产物则可同时与VIC和FAM标记的探针结合 同型突变型个体的扩增DNA只与VIC或FAM标记的探针结合 野生型 (纯合子)