现代分子生物学－实时荧光定量PCR技术的原理及应用－胡忠.ppt.ppt

TaqMan法 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析 TaqMan法 优缺点 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区域互补 重复性比较好 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点 实时荧光定量PCR 方法 3------- Molecular beacon 法(分子信标) 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素 淬灭剂 发夹型杂交探针 Molecular beacon (分子信标) 工作原理 荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -----变性过程：产生非特异性荧光 -----延伸过程：不产生荧光 ------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号 Molecular beacon (分子信标) 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析 Molecular beacon (分子信标) 优缺点 高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低 优 点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高 缺 点 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR法 标准样品 相对定量中的内标 内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA 实时荧光定量PCR法 标准样品DNA拷贝数 用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释 实时荧光定量PCR法 定量方法 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相） 2-△C（t） 双标准曲线法 实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例 TaqMan法研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异 TaqMan法举例 标记探针 使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量 Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针 TaqMan法举例 材料准备 从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的 总RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析 Controls no RNA：阴性对照 RNA + no reverse transcriptase：基因组对照 TaqMan法举例 反应程序 RT-qPCR 反应程序： 50oC,30min 95oC,15min 94oC,15sec 60oC,1min plate read 10oC,forever End 35 more times TaqMan法举例 癌症标记物表达 Color 2 - VIC detection for GAPDH Color 1 – FAM detection for ERBB2 TaqMan法举例 实验结果 单双通道相互验证 26.82 ± 0.24 28.70 ± 0.03 26.70 28.73 26.68 28.71 27.09 28.67 Carcinoma Healthy RNA B.Singleplex reactions 26.80 ± 0.32 28.65± 0.15