蛋白质化学小结.docxVIP

蛋白质化学1、简述氨基酸的结构特点及两性解离特性。答：特点：氨基酸是蛋白质分子的基本组成单位。在20种基本氨基酸中，除脯氨酸α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余L-α-氨基酸；每种氨基酸分子至少有一个氨基和一个羧基；至少有一个氨基和一个羧基链接在同一个碳原子上；各种氨基酸之间的区别在于R基团不同。两性解离特性：氨基酸分子在生理pH条件下形成了兼性分子（分子中含有等量的正电荷和负电荷，使该分子的净电荷为零）。氨基酸分子中除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在不同的pH溶液中可解离成正离子或负离子，因此氨基酸分子即可带有正电荷又可带有负电荷，这种性质称为氨基酸的两性解离。2、蛋白质一级结构测定的原理和结果分析。答：准备：样品必须纯（97 %以上）；确定蛋白质中所含的多肽链(亚基)的数目；二硫键的断裂；对每种亚基进行分离和纯化；确定亚基中氨基酸的组成。①确定蛋白质分子中多肽链的数目，利用具有特异识别位点的蛋白酶将每条多肽链酶解成可以直接进行序列测定的短肽片段(包括断开多肽链内的二硫键)；②分离并纯化各短肽片段；③确定每条片段中的氨基酸顺序；④利用不同识别位点的蛋白酶将多肽链酶解成不同的短肽片段，重复步骤①-③若干次；⑤通过比较用不同的蛋白酶切割形成的短肽片段的序列，确定每条多肽链中氨基酸的顺序N-端测序Sanger法/DNFB法/二硝基氟苯法2,4-二硝基氟苯（Sanger试剂）在碱性条件下，与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用层析法进行鉴定。丹磺酰氯（DNS）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基发生酰基化作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有强烈的荧光基团，检测灵敏度比DNFB法高100倍。Edman化学降解法/苯异硫氰酸酯/PITC法首先在pH9.0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物；随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH-氨基酸种类，从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。从蛋白质或多肽氨基末端进行分析，不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解。依不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而推断蛋白质的N-末端残基。C-端测序羧肽酶法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个水解。依不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而推断蛋白质的C-末端残基。肼解法多肽与肼在无水条件下加热，从多肽链上解离出C-端氨基酸，剩余部分变为肼化物，与C-端氨基酸分离。⑥确定多肽链内及多肽链间的二硫键的位置。（二硫键可以被过甲酸氧化或被硫醇还原而断裂。过甲酸氧化可以断裂所有二硫键，但同时氧化Met残基，并破坏Trp侧链的吲哚基团。硫醇（2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤苏糖醇）还原性裂解二硫键。）（在测定多肽链的氨基酸序列之前，了解肽链中的氨基酸组成即每种氨基酸残基存在的数量是十分必要的。）⑦将肽链完全水解以释放出所有的氨基酸，然后再对释放出来的氨基酸进行定量分析。酸催化水解法、碱催化水解法、酶催化水解法、3、对角线电泳法的原理及其应用。原理如果两次电泳间的特殊处理对蛋白质无影响，则电泳图谱中的蛋白点都在对角线上；如果该特殊处理对其有影响，则电泳图谱中的蛋白点偏离对角线。根据特殊处理的性质，可获得变化蛋白点的相关重要信息。目前其主要作用是膜蛋白的分离鉴定，及确定二硫键和蛋白质复合物的研究。应用水解后的肽混合物进行第一相电泳，样品点在中间，电泳毕，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸气处理2小时，使-S-S-断裂，此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次向成直角。在第二相电泳中，那些不含 -S-S-的电泳情况与第一相相同，因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，电荷发生变化，第二相电泳速度就与第一相不同，电泳结果这些肽斑就偏离对角线，肽斑可用茚三酮显示。对角线法由于其速度快，操作简便以及能用于小分子样品，是直接分离 -S-S-肽的好方法。含 -S-S-肽被分离后，即可进行肽段顺序分析