细菌学教学课件 第五章 细菌的基因表达.pptVIP

第五章 细菌的基因表达 一、细菌基因与基因工程概念 二、基因工程相关的酶学 三、基因工程的载体 四、细菌功能基因的结构 五、基因的转录 六、基因的翻译 七、原核基因表达系统 一、细菌基因与基因工程概念 1.1 基因是什么？ “能够表达出一个有功能的多肽链或功能RNA分子的核酸序列”。 1.2 基因工程（gene engineering) 将不同 的生物基因（供体）在体外人工剪切，组合并与载体（质粒，噬菌体，病毒）DNA连接，然后，引入原先没有这类基因的细胞（受体）内进行扩增，使转入基因在细胞内高效表达即合成该基因所编码的蛋白质或多肽。　 二、基因工程相关的酶学 1、核酸限制性内切酶（restriction endonuclease) 2、连接酶（ligase) 3、聚合酶（polymerase) 4 、DNA和RNA修饰酶 5、核酸酶 2.1 核酸限制性内切酶（restriction endonuclease) 2.1.1 核酸限制性内切酶：一类能够识别和切割某种特定核苷酸序列且能产生具有二重对称特异序列（回文序列, palindromic sequence)) 2.1.2 命名与表示： 细菌属名第一 细菌种名前两 菌株 个字母（大写斜） 个字母（小写斜） 例如：流感嗜血杆菌 Haemophilus influenza Rd(株） HindI, HindII, HindIII 方向5’ 3’ BamHI G GATCC EcoRI G AATTC SmaI CCC GGG + + 2.1.3 影响限制性核酸内切酶的活性 *DNA纯度 *DNA甲基化程度 *底物DNA的分子结构 *反应温度 *反应系统组成 2.1.4 限制性核酸内切酶应用 *DNA重组 *构建新质粒 *DNA物理图谱 *DNA分子杂交 *制备DNA放射性探针 *DNA序列分析 2.2 DNA连接酶(ligase) DNA连接酶：催化具有5’-磷酰基与3’-羟基末端彼此相邻的二条链形成磷酸二酯键的酶。 *大肠杆菌DNA连接酶 **T4 DNA连接酶 T4噬菌体DNA编码； Mg2+ 和ATP为辅助因子 粘端连接低浓度 平端连接高浓度 2.3 聚合酶（polymerase) 聚合酶：以DNA或RNA为模板，催化DNA及RNA的体外合成。 *大肠杆菌DNA聚合酶I 用于缺刻平移 （nick translation) *Klenow聚合酶 用于平末端补齐；cDNA的第二链；Sanger法测序分析 ＊ T4噬菌体DNA多聚酶 用于DNA片段末端标记 ＊ 经修饰的T７噬菌体DNA聚合酶 用于双脱氧终止法测序 * TaqDNA聚合酶 用于DNA序列分析 聚合酶链反应（PCR) *逆转录酶 （reverse transcriptase) 原核、真核生物mRNA 转录成cDNA 三、基因工程的载体 基因工程载体类型： * 质粒载体 * 噬菌体载体 * 嵌合质粒载体 * 噬菌体质粒载体 3.1 质粒载体 3.1.1 质粒：指染色体之外的，能进行复制和遗 传的双链环状DNA分子。 ＊表示符号：pBR322,pUC19, pSC101 ＊严谨型，低拷贝，１－２个质粒 ＊松弛型，高拷贝，１０－１００个质粒 3.1.2 质粒的复制 质粒半保留复制模式 严谨型质粒复制：依赖蛋白质合成与DNA聚合酶III 松弛型质粒复制：不依赖蛋白质合成，利用DNA聚合酶I ＊复制方向：单向或／和双向 3.1.3 质粒的不相容性 ＊不相容性：指某种质粒在寄主细胞存在时，将阻止其它类质粒进入细胞寄居。 ＊同一不相容群的质粒不能在同一寄主中寄居。（如质粒pBR322与pUC19都具有PMB1复制子） ＊非同一不相容群的质粒，可以在同一寄主中寄居。（如质粒pBR322与pSC101分别具有PMB1和PSC101复制子） 3.1.4 质粒的转移性 1、接合转移(conjugation) 2、转化 (transformation) *感受态转化(competent cell T.) *原生质体转化(protoplast T.) *电