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农业院校分子生物学实验方法的改进和探索 　　摘要：植物基因组DNA提取是农业院校为本科生开设的分子生物学实验中最基础的一个实验。该实验存在操作步骤繁杂，耗时长，液氮容易引起冻伤等问题，改进后，简化了实验步骤，节约了时间，避免了因学生操作不当引起的液氮冻伤。并指出实验中应注意的问题，以确保实验安全、顺利的进行。 　　Abstract： Plant genomic DNA extraction is the most basic molecular biology experiment for undergraduate students in agricultural colleges， but this experiment has some questions such as complicated procedures， time-consuming and frostbite resulting from liquid nitrogen caused by the improper operation of students， which can be avoided after improvements in order to ensure the security and the smooth going in the experiment. 　　关键词：分子生物学；DNA提取；改进 　　Key words： molecular biology；DNA extraction；improvements 　　中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2015）35-0165-02 　　0 引言 　　分子生物学实验是农业院校中为农学、园艺、植保和生物工程等专业开设的一门重要的专业基础实验课，旨在提高学生的实验技能和培养学生的科研素养。DNA是遗传信息的载体，是重要遗传物质。快速提取高质量的DNA样品是进行PCR扩增、限制性酶切、Southern杂交、测序等分子生物学实验的保障[1]。因此，“植物基因组DNA提取”实验是分子生物学实验中最基础、最常用的一个实验。选择合适的方法快速提取植物基因组DNA显得极为重要。 　　该实验采用液氮研磨植物叶片，裂解植物细胞，再利用有机溶剂多次抽提，使蛋白质等沉淀于有机溶剂中，使核酸保留在水相[2]。实验需要配制大量的提取液，而且步骤繁杂，学生常常顾此失彼，不能在规定时间内完成实验。此外，在用液氮研磨植物叶片过程中，学生们常常会因为好奇或操作不小心造成液氮冻伤情况。鉴于此，笔者对该实验操作步骤做了些适当的调整与改进，化繁为简，缩短了实验所需时间，提取的DNA质量完全能满足后续分子生物学实验的要求，而且避免了液氮对学生们引起的冻伤；同时，在实践中总结出学生实验操作中的注意事项，减少了学生实验出错的几率，提高了学生实验教学效果。现将结果报告如下。 　　1 实验的基本原理 　　植物DNA提取方法有很多，常用的方法有CTAB法、SDS法、UREA法等，这些DNA提取方法在原理上基本一致，都是用液氮研磨植物幼叶破碎细胞，利用CTAB或SDS、UREA和β-巯基乙醇蛋白变性剂，再经加热使蛋白变性与DNA分离，在此基础上EDTA鳌合金属二价离子、氯仿的抽提使DNase对DNA的作用降到最低，经离心获得含有DNA的上清液，再用乙醇沉淀，得到生物基因组DNA。 　　2 实验材料、试剂和仪器 　　①材料：用常规方法培育的大豆植株的叶片。②试剂：CTAB、乙丙醇、无水乙醇，苯酚：氯仿，TE Buffer：异戊醇（25：24：1），氯仿。③仪器：高速离心机、恒温振荡器，恒温水浴锅。 　　3 原实验步骤 　　用液氮对大豆叶片进行充分研磨，取0.2g分装到2.0mL离心管中。在离心管中加入750uL预热的CTAB提取缓冲液，用涡旋混合器充分振荡混匀，放置在65℃水浴锅中温浴30分钟。冷却4-5分钟，加入750uL苯酚：氯仿：异丙醇（25：24：1）混合，放置水平摇床混匀20分钟，12000rpm/min离心10min。取上清液于1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，水平摇床混匀5min，12000rpm/min离心10min。取上清，加入120uL异丙醇，12000rpm/min离心5min。弃上清，用乙醇洗涤、烘干后，用TE Buffer溶解。 　　4 改进后实验步骤 　　取大豆幼嫩叶片，用剪刀剪碎放入0.5ml离心管中。加200uL TPS提取液，用涡旋混合器充分振荡混匀，95℃加热10min，4000rpm/min离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇混匀，12000rpm/min离心3min。弃上清，用乙醇洗涤、烘干后，用TE Buffer溶解