细胞分离与培养技术 - 生物探索-探索生物科技价值的新媒 ….pptVIP

*;;从血液、体液中分离细胞 从原代组织中分离细胞 从原培养容器中分离细胞 -- 传代培养; 采血方法： 人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血； 小动物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。 兔 耳静脉或动脉穿刺取血。 ;血液抗凝方法： 肝素法：按每ml血液约用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4μl）； 草酸盐法：取草酸钾0.2g，草酸铵0.3g，加双蒸水10ml溶解后，取0.2ml放入5ml的试管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此试管中，轻轻摇晃； 枸橼酸钠法：先配制2%枸橼酸钠，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝； EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/L EDTA 2μl。 ;体液标本采集： 在局部70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。 ;血样中红细胞和白细胞的分离： 利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。 抗凝血，室温或37℃下直立静置30-60min，红细胞沉降至下层，中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血与3%明胶（经灭菌消毒）等量或3︰l量混合于离心管中，直立静置30-60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。 ;*;血中单核细胞的分离： 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离;黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞 ;具体步骤： 单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的细胞悬液。 先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。 将尼龙柱预温37℃，再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维柱，不使流出，37℃温箱内静置l小时。 取下注射针头，用预温37℃含20%小牛血清的RPM I-1640培养液冲洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T淋巴细胞。 从注射器内取出尼龙纤维，在4℃的RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤压，将黏附的B细胞洗脱收集（B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离）。 收集的T、B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮，洗涤，离心（250g，7min），并重复洗涤3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液。;免疫磁珠法(MACS)分离T、B淋巴细胞： 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。? ; 免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。 通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。; 免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞(CD34)、单核/巨噬细胞(CD14)、胰岛细胞(胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）) 、多种肿瘤细胞等。 ;*;*;*;MACS技术优点： 稳定、高质量的分选：纯度（90-99%） 对细胞无损伤 操作简便、快速：消毒方便，手动分选30分钟内完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。 从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1011个细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。 分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。 从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及mRNA。;流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞： 密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×107 /ml； 加适量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4℃孵育30min, 用RPMI-1640培养基洗2次； 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。 ;注意事项： 分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。 此法分离得到的T细胞纯度可达到99%,收获率可达到9