HPLC培训(峰与色谱条件)选编.ppt

HPLC; 基本原理 加样 流动相 流动相 A C B B C A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。 ;基本操作; 流动相的配制 ①配制用水最好用蒸馏水（注射水） ②称量??量取、调pH时尽可能精确 ③流动相必须用0.45um滤膜过滤，注意区分有机膜、无机膜 ④加入甲醇或乙腈后要混合充分 ⑤流动相必须经过脱气（常用方法是超声脱气） ⑥配制所用的试剂尽可能用色谱纯，如没有色谱纯可用分析纯代替 ⑦流动相应现用现配制，染菌的流动相禁止使用 ⑧配制过程中应注意自我保护 ;流动相使用前为什么要脱气？ ;色谱柱的良好使用规范;最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键 合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥 着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。 由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对 各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应 用的最为广泛。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 （由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯）;色谱柱的故障诊断-- 基线噪音;色谱柱故障诊断--基线漂移;色谱柱故障诊断--鬼峰;色谱柱故障诊断-- 峰形问题;色谱柱故障诊断--峰形问题;色谱柱故障诊断-- 峰形问题;色谱柱故障诊断-- 峰形问题;手动进样器的使用、维护;系统适应性试验;色谱柱的理论塔板数（n）;分离度（R）;重复性;拖尾因子（T）;系统适应性试验1.理论塔板数 n2.分离度 （R≥ 1.5）3.重复性 RSD=0.1%4.拖尾因子 T=1.04;替硝唑含量;含量测定-内标法;含量测定-外标法;替硝唑有关物质;有关物质;2.不加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配制对照品溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照品溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。 若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录??体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，计算各峰面积，即