PCR技术及PCR仪分解.ppt

PCR技术及PCR仪;目 录;;;;;;Kary B. Mullis;故事发生在1983年的春夏之交;Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…...;Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……;Mullis的第一个PCR实验;PCR的发展史;;PCR不只是一个方法改进;生物样品;基因组DNA;DNA聚合酶;引物;94℃变性;94℃;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus);72℃;;;;;;;;;; ;;PCR具有极高的灵敏度;PCR;引物设计： （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。;3’;1）PCR反应成分;（2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;耐高温DNA聚合酶的种类;PCR反应中Taq酶的选择;;（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;2）循环参数  ;(2)退火(复性)温度与时间： 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ;（3）延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 ; （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加;PCR产物生成曲线;log[DNA];PCR的类型和应用;PCR相关的术语和产品层出不穷;1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究; ;2)反向PCR (reverse PCR) ;已知序列;3）多重PCR;4）LP-PCR（Labelled primers);标记引物;5）锚式PCR;cDNA;6）原位ＰＣＲ; 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10