ISSR(inter-sequencerepeat)分子标记的实验原理及操作流程.doc

ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记的实验原理及操作流程 ISSR（inter-simple?sequence?repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在?3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在?SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。 关键词： HYPERLINK "/tag.php?tag=%B1%EA%BC%C7" 标记 HYPERLINK "/tag.php?tag=%B7%D6%D7%D3" 分子 HYPERLINK "/tag.php?tag=ISSR" ISSR HYPERLINK "/tag.php?tag=inter-simple" inter-simple HYPERLINK "/tag.php?tag=sequence" sequence HYPERLINK "/tag.php?tag=repeat" repeat HYPERLINK "/tag.php?tag=SSR%D2%FD%CE%EF" SSR???物 HYPERLINK "/tag.php?tag=RAPD" RAPD HYPERLINK "/tag.php?tag=%B7%D6%D7%D3%B1%EA%BC%C7" 分子标记 HYPERLINK "/tag.php?tag=%B5%A5%B9%D1%BE%DB%BA%CB%CB%E1" 单寡聚核酸 ISSR标记 ISSR（inter-simple?sequence?repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在 3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在 SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA 中SSR的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。 ? 一、实验材料 　　不同来源的 DNA(30-50ng/ul)。? 二、实验设备? 　　 HYPERLINK "/yp/product-list-127.html" \t "_blank" PCR仪， HYPERLINK "/yp/product-list-1063.html" \t "_blank" PCR管或硅化的 0.5ml?eppendorf管，电泳装置， HYPERLINK "/yp/product-list-234.html" \t "_blank" 凝胶成像仪。? 三、试剂? 　　1、 ISSR引物：购买成品或根据加拿大British?Columbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成。? 　　2、Taq酶 　　3、10xPCR?缓冲液 ??????? 4、MgCl2：25mmol/L。? 　　5、 dNTP：2.5mmol/L。?? 四、操作步骤：? 　　1. 在25ul反应体系中，加入? 　　　　模板DNA 1ul (30-50ng)? 　　　　ISSR引物 1ul (约5pmol)? 　　　　10xPCR Buffer 2.5ul? 　　　　MgCl2 2ul? 　　　　dNTP 2ul? 　　　　Taq酶 1单位（U）? 　　　　加ddH2O 至 25ul? 　　混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。? 　　2. 在 HYPERLINK "/yp/product-list-127.html" \t "_blank" PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 45℃-68℃ 40秒， 72℃ 1-2分钟，共40轮循环。? 　　 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 　　4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6% 或1.8%  HYPERLINK "/yp/product-list-642.html" \t "_blank" 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。? 　　5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。 6. 用 HYPERLINK "/yp/product-list-234.html" \t "_blank" 凝胶成像仪观察、拍照。? 操作流程简图： 注：样品