33182水痘病毒滴度标准操作规程.docVIP

文件名称水痘病毒Oka株病毒滴定标准操作规程文件编号YY-33001-2016(01) 页 码 第 页 共 页起 草 人 季绿江起草日期 2016年 3 月 10 日审 核 人审核日期 年 月 日批 准 人批准日期 年 月 日执行日期 年 月 日版 本 号01分发号 目的：建立水痘病毒Oka株病毒滴定标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。 2、范围：适用于水痘病毒Oka株病毒滴定测定。 3、编制依据 《企业注册标准WS4-(S-009-2)-2003Z》。 4、病毒滴定操作规程 4.1试药与试液 1、细胞：2BS株人二倍体细胞。 2、液体：0.25%胰蛋白酶溶液；0.94%MEM溶液；3%L-谷氨酰胺溶液；8%碳酸氢钠溶液：0.5%硫酸新霉素溶液；小牛血清；PBS缓冲液；50%蔗糖溶液；10%谷氨酸钠溶液；1%考马斯亮蓝溶液。 3、其他：灭菌注射用水（疫苗成品稀释剂）。 4.2仪器与用具 1、CO2培养箱； 2、倒置生物显微镜。 4.3操作方法 4.3.1细胞培养 挑选细胞形态佳、无污染的2BS株人二倍体细胞，弃旧生长液，细胞面经少量胰蛋白酶消化液洗涤后，加入消化液适量，置37.0℃±0.5℃孵育直至细胞疏松，弃消化液，加入适量生长液，用吸管吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。将细胞悬液接种于六孔培养板，每孔3ml，置37.0℃±0.5℃、5%CO2培养箱培养至单层。 文件名称水痘病毒Oka株病毒滴定标准操作规程文件编号YY-33001-2016(01) 页 码 第 页 共 页起 草 人季绿江起草日期 2016年 3 月 10 日审 核 人审核日期 年 月 日批 准 人批准日期 年 月 日执行日期 年 月 日版 本 号01分发号4.3.2病毒接种 4.3.2.1病毒稀释 1、复溶：待检样品如为疫苗成品，每瓶疫苗用配套稀释液溶解，每批取 3瓶疫苗的溶液混合滴定。 2、将待检样品进行10倍系列稀释。 4.3.2.2接种 选择生长状态好、无污染的单层2BS株人二倍体细胞，吸出旧培养液，接种不同稀释倍数的病毒稀释液，0.1ml/孔，每稀释度病毒液接种2孔，轻轻摇动，置36.5℃±0.5℃、5%CO2培养箱吸附60分钟，期间至少每隔20分钟轻轻摇板1次。每次试验留取2孔细胞不接种病毒作为空白对照。吸附完毕，补加维持液，3ml/孔，置36.5℃±0.5℃、5%CO2培养箱培养7天。 4.3.3染色 取培养到期的细胞培养板，吸出培养液，用PBS缓冲液洗涤培养板各孔细胞面，每次10ml/次，共洗3次。加染色液，1ml/孔，置室温5分钟。吸出染色液，用流水冲净，晾干， 4.4计算 1、计每孔10~50个以内的蚀斑数并求出该稀释度的平均蚀斑数； 2、计算样品蚀斑形成单位（PFU）； 3、计算样品病毒滴度（lgPFU/ml或lgPFU/剂）。 4.5填写记录： 1、随试验进程做好试验记录(按实验记录规范要求)，包括试剂盒的厂家、批号、效期, 试验时间,试验结果。签字 2、填写仪器使用登记。 文件名称水痘病毒Oka株病毒滴定标准操作规程文件编号YY-33001-2016(01) 页 码 第 页 共 页起 草 人季绿江起草日期 2016年 3 月 10 日审 核 人审核日期 年 月 日批 准 人批准日期 年 月 日执行日期 年 月 日版 本 号01分发号 3、填写检测报告。 4.6 复核人复核 按检测工作程序，将检测原始记录、检测报告交复核人复核、签字。 4.7结果与判定 病毒滴度37℃放置前后均不得低于3.3LgPFU/0.5ml，37℃放置7天后滴度下降应不高于1.0LgPFU/0.5ml。 4.8检测结果的报告 经部门负责人审核后、签字，发最终检测报告。