实验一菠萝蛋白酶的初级纯化及鉴定陈.doc

实验一 菠萝蛋白酶的初级纯化及鉴定 一、 目的： 系统地学习和掌握蛋白质分离纯化技术的原理及实验技术。熟练掌握饱和硫酸铵沉淀法、透析法、测定蛋白质含量、蛋白酶活性检测等实验技术。 二、 原理： 要研究某种蛋白质的结构和功能，生产高生物活性的蛋白类激素、酶等，第一步工作就是从复杂的混合体系中分离（ Separation ）出蛋白质并且进行纯化（ Purification ）分析。 1 蛋白质分离纯化的一般程序： ?? 选择一种目的蛋白质含量丰富、稳定性好的样品材料。 ?? 将蛋白质从样品中抽提出来。 ?? 确定分离纯化的方法，使粗品的纯度达到预定要求。 ?? 建立灵敏、特异、精确的检测手段，分步测定蛋白质的含量，检验蛋白质的纯度。 ?? 在操作、分析过程中注意保护蛋白质的稳定性，防止变性。 2 蛋白质的分离纯化方法： 利用溶解度不同的分离纯化方法有：盐析法、 等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇沉淀法等。 盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶（ Salting in ）。但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。这是因为蛋白质分子吸附某种盐离子后，其带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。但当大量中性盐加入，使水的活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 用于盐析的中性盐通常有硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁等，而以硫酸铵为最佳，它在水中溶解度大而温度系数小（在 25 ℃时，溶解度为 767g/L ；在 0 ℃时，溶解度为 697g/L ） , 分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉可得。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度可适当地将蛋白质分开。如鸡蛋清中的球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱和硫酸铵中沉淀。 对于含有多种蛋白质或酶的混合液，可采取分段盐析的方法进行纯化。添加硫酸铵到所需浓度的方法有： （ 1 ）加饱和硫酸铵溶液，公式如下： V=V0（ S2 –S1 /1-S1） 式中， V ：为需加入饱和硫酸铵的体积（ ml ）； V0：为原来溶液的体积（ ml ） ; S2：为需达到的硫酸铵饱和度； S1 ：为原来溶液的硫酸铵饱和度。 （ 2 ）将固体硫酸铵直接加入到原蛋白质溶液中，可从有关生物化学实验书附录中查“ 硫酸铵溶液饱和度计算表”，获得所需要添加的硫酸铵的量。 3? 透析和超滤 透析（ Dialysis ）和超滤（ Utrafiltration ，超过滤）就是利用蛋白质分子不能通过半透膜（ Semipermeable membrane ） , 而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。 透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，扎紧袋口放在蒸馏水或缓冲液中进行的。 透析时，不断更换透析外液，直到口袋内小分子物质降低到最小值为止。 超滤是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。超滤膜是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素和尼龙等高分子聚合物制成的多孔薄膜，截留的颗粒直径从 2-20nm ，相当于分子量 1000-5 x 105 。超滤技术不仅使蛋白质得以分离纯化，还达到浓缩的目的。超滤、浓缩、去热源、脱盐及富集病毒、细胞等工艺。 4 菠萝蛋白酶活性测定 酪蛋白是一种蛋白质，它被菠萝蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定菠萝蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说菠萝蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。 三.实验材料 新鲜菠萝（ 1个 约500g） 四.仪器设备 （ 1 ） 电力搅拌器（或家庭用的电力搅拌器） （ 2 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式） （ 3 ） 752 紫外分光光度计（石英比色杯） （ 4 ） 722分光光度计 (玻璃比色杯) （ 5 ） 磁力搅拌器 （ 6 ） 水浴箱 （ 7 ） 电子天平；台式天平（离心平衡用） （ 8 ） 剪刀 （ 9 ）冰箱 （ 10 ）蒸馏水瓶（ 25L 或 50L ）。 五.玻璃器皿 1 以组为单位 试管 （ 15个）， 100 mL 烧杯（ 2 个）， 200 mL 烧杯（ 1 个），吸管（ 2 个）、玻棒（ 1 个）， 移液管或移液器 5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 个），滤纸（ Φ8cm ）， 100mL 量筒（ 1 个）。 2 全班共用 1000 mL 试剂瓶（