植物提取物的分离纯化技术.doc

苍山大蒜低聚糖纯化技术研究及分子质量测定 摘要：本论文旨在建立苍山大蒜中低聚糖（GOS，Garlic oligosaccharide）的分离纯化技术，并测定其分子质量。分别研究了聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、有机溶剂沉淀法和葡聚糖凝胶色谱法对GOS的纯化效果。结果表明，聚酰胺色谱柱对大蒜粗糖中蛋白质的脱除率为66.8%，糖回收率为98.9%；经DEAE-纤维素（OH-）色谱柱、乙醇分级沉淀和Sephadex G-25色谱柱纯化后，GOS的纯度为99.1%，数均分子质量为1770D，。 关键词：大蒜；低聚糖；分离纯化 大蒜营养丰富，在我国历来被视为药食两用的佳品。据报道，大蒜有降血脂、抗菌消炎、抗肿瘤、保护肝脏和抗衰老等作用[1-3]。其中，大蒜中的糖类物质是蒜中的主要活性成分之一[4-8]。大蒜低聚糖属杂果聚糖[8-10]，具有益生元的作用[11]。低聚果糖有双向调节人体肠道微生态的功能，且低聚果糖很难被人体消化吸收，是一种低能量的糖，不会引起肥胖。低聚果糖作为一种水溶性膳食纤维，能降低血清胆固醇和甘油三酯含量，所以低聚果糖也可作为高血压、糖尿病和肥胖症等患者使用的甜味剂[12]。 由于大蒜产地和品种等不同，对经分离纯化得到的大蒜多糖性质的研究报道并不一致。苍山大蒜的外形较差，不宜作为商品直接出售。但苍山大蒜富含低聚糖，具有较高的开发利用价值。本文旨在建立苍山大蒜低聚糖的分离纯化技术，并测定其分子质量，为大蒜低聚糖的进一步研究及应用提供基本方法。 材料与方法 1.1 材料与试剂 大蒜 苍山大蒜；聚酰胺（30-60目） 国药集团上海试剂公司；DE-52 Whatman公司；Sephadex G-25、蓝色葡聚糖-2000 Pharmacia公司；果糖标准品 Amresco公司；多糖标准品 Fluka公司；其它试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器与设备 TDZ5-WS型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；IGJ0.5冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；752型紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；BS-100A自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司；高效液相色谱系统 日本岛津公司；高效液相色谱柱 奥秘BauloSB5-2546-c18-060 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。 1.3 技术路线 鲜蒜→高温灭酶→破碎→提取→沉淀→冻干→纯化 1.4 方法 大蒜粗糖提取采用本实验室前期建立的方法[13]。 1.4.1蛋白质脱除效果的比较研究 Sevag法对蛋白质的脱除效果研究：称取10.0g粗糖干粉溶于100mL蒸馏水中，配成粗糖溶液，加入20mL的Sevag试剂（氯仿：正丁醇=5：1，V/V），剧烈振摇20min，静置30min，3000r/min离心15min，收集上清液，重复操作数次，至无变性蛋白质出现为止。考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量[14]，苯酚-硫酸法测定总糖含量[15]，计算糖损失率和蛋白质脱除率。 聚酰胺柱色谱法对蛋白质的脱除效果研究：取一定量的大蒜粗糖上样（φ2.5cm×34cm），蒸馏水洗脱，分别采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝G-250法测定洗脱液中的总糖和蛋白质含量。计算糖损失率和蛋白质脱除率。 量取7mL聚酰胺装柱（φ1cm×20cm），2g粗糖上样，蒸馏水洗脱，至无糖洗出为止。测定洗脱液中蛋白含量，计算动态吸附容量。 1.4.2 大蒜低聚糖的DEAE-纤维素色谱柱法纯化 经脱蛋白后的大蒜低聚糖1.5mL上样（f8mm×170mm），上样浓度为5%（g/mL），梯度洗脱，流动相分别为：蒸馏水，0.05mol/L NaCl，0.10mol/L NaCl，0.15mol/L NaCl，0.20mol/L NaCl，0.25mol/L NaCl，0.20mol/L NaOH。自动部分收集器收集洗脱液（3min/管），共收集98管，苯酚-硫酸法测每管总糖含量，绘制洗脱曲线。收集主要组分，采用HPLC测定其分子质量分布。色谱条件为：GPC色谱柱：SB-802.5；流动相：三蒸水；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；柱压：3.0MPa；示差折光检测器检测。 1.4.3 大蒜低聚糖的沉淀法分级纯化 称取2.0g经DEAE-纤维素色谱柱纯化得到的中性糖，溶于10mL蒸馏水。加10mL 95%（V/V）乙醇，4℃静置2h，3500r/min离心15min，收集沉淀（记作沉淀1），上清液继续加10mL 95%（V/V）乙醇，收集沉淀2，重复上述步骤8次，最后一次醇沉后，上清液水浴挥干，收集干物质。HPLC测定不同沉淀组分的分子质量分布（方法同1.4.2）。 1.4.4 大蒜低聚糖的葡聚糖凝胶Sephadex G-25色谱柱法纯化 取分级沉淀5至8的合并样品10mg溶解上样（