液相色谱-串联质谱法同时测定猪尿中的22种违禁药物20121208.doc

液相色谱—串联质谱法同时测定猪尿中的22种违禁药物 王旭峰 张高奎 杨建文 卞愧 王宗楠 王立琦 张桂君 贺利民* （华南农业大学兽医学院兽医药理研究室，广州 510642） 摘要 建立了液相色谱串联电喷雾质谱同时测定猪尿液中22种违禁药物的分析方法。猪尿样真空冷冻干燥处理，用10%甲醇水（0.1%甲酸）溶液复溶， Anpel MCX固相萃取小柱净化、富集。以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，经CNW Athena C-18色谱柱（150 mm×2.1 mm, 5 ?m）分离，采用电喷雾电离，多反应监测正离子模式对22种药物进行定性和定量分析。采用基质匹配标准溶液校正，各个药物的响应与其质量浓度在0.5~100 ?g/L范围内呈良好的线性关系, 相关系数(r)大于0.99；以3倍信噪比(S/N)和10倍S/N计算方法检出限和定量限，分别为0.5~4 ?g/L和1~10 ?g/L；在LOQ、10、20及50 ?g/L四个添加水平，猪尿中22种药物的平均回收率为50.2%~97.7%；日内相对标准偏差（RSD）和日间RSD分别为1.0%~8.6%和4.7%~17.9%。实验结果表明，该方法简单、灵敏、可靠，适用于猪尿β-受体激动剂类、激素类、硝基咪唑类和镇定类等22种违禁药物残留的确证分析。 关键词 液相色谱-串联质谱；违禁药物；多残留检测；猪尿 1 引 言 在畜牧业生产中兽药、促生长剂的使用日益频繁，动物性食品中的兽药残留和食品安全问题成为消费者关注的焦点[1] ADDIN NE.Ref.{4381EBC1-3395-4052-89FB-0CC8CB83F29B}。我国农业部2002年底颁布的235号公告[2]中明确规定禁止用于食品动物的药物31种（包括克伦特罗等β-受体激动剂类、激素类、硝基呋喃类、硝基咪唑类和镇定类等），限制使用（允许作治疗用，不得在动物食品中检出）的药物9种（氯丙嗪、赛拉嗪、安定、地美硝唑、甲硝唑、苯甲酸雌二醇、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮及潮霉素B）。目前，对这些违禁药物在动物食品中残留的分析检测和筛查需要采用数种分析方法[3~6]，既缺乏时效性也浪费大量人力、物力和财力。开展动物食品中违禁药物的高通量分析筛查方法研究具有重要意义。 国外采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析检测动物食品[7~9]及环境水、土壤[10,11]中的多类药物残留检测的报道较多 ADDIN NE.Ref.{6C432185-EF87-4CDF-B81B-76735D575E01}；国内，有采用LC-MS/MS分析检测畜禽肉、牛奶基质中3类20种兽药的检测和猪肉、猪肝、虾、牛奶和鸡蛋中6类76种兽药残留同时测定的报道[12,13]，但关于其它食品基质、饲料及尿液中多残留检测的报道较少。本研究针对我国动物食品中违禁药物残留监测被动的局面，开展采用LC-MS/MS进行高通量禁用药物筛查，建立了猪尿中建立了猪尿中β-受体激动剂（西马特罗、沙丁胺醇、克伦特罗）、硝基咪唑类药物（甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑）、农药（双甲脒、克百威）、镇定类药物（赛拉嗪、氯丙嗪、安眠酮、地西泮）、激素类药物（群勃龙、诺龙、甲睾酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮、醋酸甲孕酮）、孔雀石绿、隐形孔雀石绿、硝呋烯腙、氨苯砜等22违禁农兽药的多类多残留分析检测方法。方法简单、灵敏、可靠，各项技术指标满足实际样品中禁用药物残留检测要求。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Agilent 1200 高效液相色谱系统（安捷伦公司）；API 4000 电喷雾-串联四级杆质谱仪（应用生物系统公司）；氮气吹干仪（美国Zymark公司）；固相萃取仪（Waters公司）；真空冷冻干燥机（德国Thyracont Elektronic GmbH）。 对照品（纯度99%，中国兽医药品监察所，Sigma公司及Dr. Ehrenstorfer GmbH），甲醇、乙腈、甲酸及乙酸铵（色谱纯，美国Fisher Scientific公司），其它试剂为分析纯。猪尿试样由农业部畜禽产品质量监督检验测试中心(广州)提供，处理前于-20℃冷冻保存。 2.2 实验方法 2.2.1 猪尿样品前处理 量取1 mL猪尿试样置于10 mL离心管中，-20℃冷冻1 h，转移至-80℃条件下真空冷冻干燥8 h，残渣加入5 mL 10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液，超声5 min溶解，离心后净化。 用甲醇活化Anpel MCX SPE小柱，3 mL水和2%甲酸水溶液平衡。将5 mL复溶液全部过柱，依次用2%甲酸水溶液和10%甲醇水溶液淋洗，抽干后用3 mL 5%氨化甲醇洗脱。洗脱液于40℃水浴中吹干，加1 mL 10%甲醇水（含0.1%甲酸及10 mmol/L乙酸铵）溶液超声溶解，过0.22??m滤膜，上