辛巴蓝F3GA修饰的啤酒废酵母菌亲和吸附溶菌酶.doc

辛巴蓝 F-3GA 修饰的啤酒废酵母菌亲和吸附溶菌酶 摘 要 利用三嗪染料辛巴蓝 F-3GA 修饰经戊二醛交联的啤酒废酵母菌，得到一种新型染料亲和吸附剂。辛巴蓝 F-3GA 的固载量为 161． 1 mg/g。以溶菌酶为研究对象，考察吸附时间、酶初始浓度、pH 值、离子强度等因素对吸附率的影响。结果表明: 当 pH =7． 0 时，其对溶菌酶有较高的吸附量( 229． 1 mg/g) ，吸附性能明显优于未接枝 F-3GA 的交联菌。负载的溶菌酶用 1． 0 mol/L NaSCN 溶液洗脱，洗脱率高达 89． 1%，酶活性保持率为 91． 0%。将其用于鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化，酶活力收得率为 73． 5%，纯化倍数为 26． 7。 关键词 啤酒废酵母菌; 辛巴蓝 F-3GA; 染料亲和吸附; 溶菌酶 1 引 言 溶菌酶( Lysozyme) 是糖苷水解酶 ［1］ ，因其可选择性地分解微生物的细胞壁而具有杀菌、抗病毒、抗 肿瘤细胞等功效，在食品工业、医疗、生物学等领域广泛应用 ［2 ～4］ ，常用于治疗慢性鼻炎、急慢性咽喉 炎、口腔溃疡、水痘等疾病 ［5］ 。 亲和吸附具有高选择性，可从复杂生物体系中高效、快速地分离出相应的目标产品，在蛋白分离纯 化过程中有广阔的应用前景。目前，染料配基由于价格低廉，性质稳定，与蛋白结合容量大，已被固定在 葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖等不同基质上，并成功用于脱氢酶、激酶、水解酶及血浆类蛋白的分离纯化 ［6 ～8］ 。 但多数基质性质不稳定，机械强度小，价格昂贵，预处理过程繁琐，而利用戊二醛交联的啤酒废酵母菌作 为吸附基质，机械强度高，非特性吸附较小，廉价易得，既可增大吸附剂在实际中的应用范围，降低染料 亲和吸附剂成本，还能减轻啤酒废水的处理负荷和难度。 啤酒废酵母菌体表面保留了与活菌体相同的可修饰功能团，因而可实现戊二醛交联菌上辛巴蓝 F-3GA 的接枝，制得一种新型染料亲和吸附剂。本实验考察了该吸附剂对溶菌酶的吸附性能，并将其用 于鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化，结果满意。 2 实验部分 2． 1 仪器与试剂 RENISHAW in Via Raman Microscope( UK) ; LAMBDAB1035 紫外可见分光光度计( 美国珀金-埃尔 默公司) ; SHZ-03 恒温水浴摇床( 上海堪鑫仪器设备有限公司) ; TGL-16G 台式离心机( 上海安亭科学仪 器厂) ; BX51 荧光电子显微镜( 日本奥林巴斯公司) ; MAXI-DRYLYO 真空浓缩( 冻干) 系统( 捷克 HETO 公司) 。啤酒废酵母菌( 湖北某啤酒厂) ; 辛巴蓝 F-3GA，溶菌酶，溶壁微球菌干粉均购自 Sigma 公司; 其 它试剂均为分析纯。 2． 2 实验方法 2． 2． 1 戊二醛交联菌与辛巴蓝 F-3GA 修饰菌的制备 取 1． 5 g 干燥的啤酒废酵母菌，加 50 mL 蒸馏 水，振荡 1 h，加 2 mL 50%戊二醛溶液，于 30 ℃水浴摇床中振荡反应 14 h 后，以去离子水洗涤，冷冻干 燥后得交联菌。 在 100 mL 三颈瓶中加入1． 0 g 交联菌，400． 0 mg 辛巴蓝 F-3GA，40 mL 蒸馏水，于60 ℃水浴中搅拌 反应 30 min。加入 4． 0 g NaCl，反应 30 min 后加入 0． 4 gNa 2 CO 3 ( 调 pH≈10． 0) 继续反应 3 h，产物趁热 第 39 卷 2011 年 1 月 分析化学 ( FENXI HUAXUE) 研究简报 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 1 期 91 ～ 94抽滤，用水、乙醇和丙酮反复洗涤，40 ℃真空干燥，得到蓝色修饰菌。 2． 2． 2 吸附剂合成条件优化 取交联菌 0． 5 g，确定反应液总体积 20 mL，反应温度 60 ℃ ，加入 0． 2 g 无水 Na 2 CO 3 ，按 2． 2． 1 节的方法进行三因素三水平正交实验，反应时间 ( 因素 A) 为 2、4 和 6 h; 辛巴蓝 用量( 因素 B) 为 50． 0、80． 0 和 100． 0 mg; NaCl 用量( 因素 C) 为 1． 0、2． 0 和 3． 0 g。 2． 2． 3 菌体表面形态及拉曼光谱表征 用荧光电子显微镜观察交联前后菌体表面形态变化。选择氩 离子激光器，激光波长 514 nm，对修饰前后菌体进行拉曼光谱表征，比较拉曼谱图变化。 2． 2． 4 吸附与洗脱实验 分别取 25． 0 mg 干燥的交联菌与修饰菌各 3 份，置于 3 个 50 mL 锥形瓶中， 1 和 2 号各加入 10 mL 磷酸盐缓冲溶液，3 号加入 10 mL 0． 4 g / L 溶菌酶溶液，放入 30 ℃