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3_zhou目的蛋白质表达、纯化、检测
实验五
目的基因的原核表达及检测;实验目的;实验原理;目的蛋白质的诱导表达
目的蛋白质的纯化
目的蛋白质的检测
;蛋白质的表达:将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。
体内很难分析单个蛋白质的作用
进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究
应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面;图 pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16 peptides 融合蛋白
在Hela细胞中的荧光显微镜检测(×400);酵母表达系统
昆虫表达系统
哺乳动物细胞表达系统
表达的蛋白具有正常的活性、构象
技术难度较大、耗时、耗资;原核细胞表达系统菌株
菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。
堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。
大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。 ;原核表达质粒的构建
目的基因
表达载体;目的基因 / DNA / PCR / 酶切 / Primer
例:
p38中抑制多肽16肽序列
GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC
F 5’-ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT-3’
R 5’-ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG G-3’
5’端引物中AC是随机保护碱基,G GAT CC是BamH I酶切位点,TA是为防止移码而引入的两个碱基,随后是编码16肽前7个氨基酸的碱基序列。
3’端引物中AC是随机保护碱基,G GAT CC是BamH I酶切位点,TAA是终止密码子的反向互补序列,随后是从编码16肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。;;表达载体
能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件,就构成了表达载体。
元件
启动子、终止子、核糖体识别序列
诱导性表达所需要的元件
操纵子序列
调控基因
多克隆位点
融合Tag
复制起始序列
筛选标记/报告基因
各种表达载体的不同之处
在于其表达元件的差异。;启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac,PL和PR,T7是最常用的启动子,
转录终止子
核糖体结合位点;用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 (Tag)。
标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端,能够与目的基因融合表达(N端或者C端融合表达)。
目前常用的标签有
组氨酸标签(His-Tag)
谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferase)标签(GST-Tag)
硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)标签
麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein, MBP)
蛋白质 A(protein A)
纤维素结合位点(cellulose binding domain)标签等。
一般对于小分子用较大的Tag(如GST)以获得稳定表达;而一般的基因多选择小Tag(如His)减少对目的蛋白的影响。;筛选标记/报告基因表达
抗药性基因,Amp是最常见的筛选标记,kana,新霉素,四环素,红霉素和氯霉素。
抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰,比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。
GFP(绿色荧光蛋白)是最常用的报告基因了,半乳糖苷酶,荧光素酶。
一些融合表达Tag也有报告基因的功能。;常用表达载体
pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达系统的载体。
Ptac Promoter
Amp
pGEX - KG
pET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。
T7
Kana
pET - 14b;;目的蛋白质的诱导表达
lacI q(Lactose)
lacI是大肠杆菌中lac 操纵子(Operon)的调节基因,它所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因(Operator)的抑制因子,抑制转录启动。
当有乳糖存在时,这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制,使lac 操纵子上的结构基因lacZ(β-半乳糖苷酶)、lacY(透性酶)、lacA(乙酰基转移酶)得以正常表达,启动转录。
IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制,因此IPTG经常作为lac 操纵子的诱导剂而使用。;AmpR;BamH I;原核表达的诱导条件
IPTG浓度: 0.01-5mmol/L
诱导时间:~3h
诱导温度:15-42℃ ;目的蛋
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