单基因遗传病的研究策略_2013.pptVIP

单基因遗传病的研究策略;如果一种遗传病的发病仅仅涉及到一个基因，这个基因称为主基因(major gene)，其导致的疾病称为单基因病。;单基因遗传病发病的复杂性;研究策略与方法;临床诊断、家系调查与材料收集;临床诊断;家系调查与系谱分析;;散发病例;临床遗传病家系特点;收集材料;收集临床资料;侯选基因的确定;文献检索;根据疾病名称检索;根据基因检索;检索最新文献;确定已知致病基因突变; 获得已知基因基因组序列 设计引物或参考文献中引物 根据文献，采用合适的技术方法进行基因突变分析（在后面课程中详细介绍）; PCR-测序分析MFN2基因; 根据变异导致的结果判断 根据突变数据库和文献资料 排除已知SNP 根据家系共分离与否判断 在正常对照人群中分析 保守性分析 基因功能分析;连锁分析与未知基因的基因定位; 利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。;连锁;遗传标记;连锁分析结果;连锁分析结果;基因定位：将致病基因确定到染色体的实际位置;定位克隆;例：一个X连锁肌肉病家系致病基因的定位克隆研究 ;家系情况及前期研究基础;研究策略;SNP芯片数据分析 连锁分析 提示X染色体有三段连锁区域：;单体型分析;?;精细定位分析 将Xp22.32-p22.2连锁区域由6.78Mb 缩短为4.18Mb ;排除Xp21.2-p21.1连锁区域 ;肯定Xq24-q27.2连锁区域 ;最终确定两段连锁区域 ;连锁区域内包含的基因 Xp22.32-p22.2连锁区域 共28个基因：14个已知基因,14个预测基因 14个已知基因： 6个基因在肌肉组织中表达 （3个基因表型已知，均与肌肉病无关） 7个基因不在肌肉组织表达 1个基因表达情况未知 ;Xq24-q27.2连锁区域 共272个基因：122个已知基因,150个未知基因 122个已知基因： 79个基因在肌肉组织中表达 （18个基因表型已知，其中包括前期已经排除的FHL1基因） 41个基因不在肌肉组织表达 2个基因表达情况不清楚  ;外显子组测序 平均覆盖度：23.8× ；覆盖度大于20×位点占53.7% 在上述两个连锁区域测序深度均很低 对测序深度20的变异位点进行验证，结果均无变异 ;存在的问题及解决办法 本家系患者未进行肌肉活检 将进行多个样本的外显子组测序;;例：非综合征型先天缺牙的分子遗传学研究 J Dent Res, 2009; 88:126-131 Eur J Med Genet, 2008; 51: 536-546 Eur J Med Genet, 2011; 54: 377-382 ;;—— 隐性突变往往导致失去功能（loss of function） —— 显性突变可导致获得功能（gain of function）和失去功能 失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency） 获得功能：显性负效应（dominant negtive） ;Gain of function ： Loricrin基因突变获得核转位的新功能   Br J Dermatol, 2008; 159:714-719 ;Loricrin 角皮病;连锁分析与1q21区域连锁;发现Loricrin基因新突变;特殊的临床表现;突变蛋白序列新功能的预测;GFP表达载体的构建;细胞亚定位分析;动物模型;基因敲除小鼠表型基本正常;转基因小鼠表型与人类疾病相似;结 论 ;Haploinsufficiency ： PAX6基因单倍剂量不足影响胰岛素成熟过程导致糖耐受异常 Diabetologia. 2009; 52:504-13;;在该家系发现 PAX6 突变(c.1080CT)导致单倍剂量不足 ;Ton et al. Cell 67, 1991;Essential for the development of the eye brain homozygous mutants — no eyes, no brain, die heterozygous mutants — small eyes in mice aniridia in humans Essential for the development of pancreas homozygous mutants — ab