PGS操作规范化流程.docxVIP

PGS 精细化操作流程 MDA 法全基因组扩增 (注:为避免DNA污染,需在超净工作台中操作,操作前紫外杀菌30min?使用无菌 耗材,且使用带滤芯的吸头) 1、准备Buffer DLB:将Buffer DLB管离心使干粉聚集到管底,加 500μl无核酸酶水,Vortex彻底混匀使其溶解,短暂离心?(溶解后BufferDLB可在-20°C保存6个月) 2、准备Buffer D2:(下表为配制12个反应,-20°C可保存3个月) ComponentVolume1M DTT3 μlBuffer DLB33μlTotal36 μl 3、将细胞样本离心,使其离心至管底,用PBS补至4μl? 4、加3μl Buffer D2,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心? (注:加反应液时枪头不要碰到细胞样本以免带走细胞?细胞样本液一般为1-2μl?) 5、PCR仪上65°C孵育10min,【程序设MDA1】加热盖(热盖温度可设为90°C)?取出时放冰上. 6、反应完成后立马加3μl Stop Solution,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心,放冰上? 7、冰上融化REPLI-g sc DNA Polymerase(最后加入),其余组分室温融化后vortex混匀,瞬时离心后放置冰上?按照下表配制反应: ComponentVolumeH20 sc9μlREPLI-g sc Reaction Buffer29 μlREPLI-g sc DNA Polymerase2 μlTotal40μl  (注:Reaction Buffer解冻后可能会有沉淀,Vortex约10s使其彻底溶解后用) 上述反应液混匀后取40μl加入步骤6的10μl DNA中,混匀,瞬时离心? PCR仪上30°C孵育8h?(热盖温度为70°C) PCR仪上65°C孵育3min使酶失活?【程序设MDA2】 11、扩增产物4°C短期保存,若长期保存则置于-20°C。 MDA产物纯化 ( Wizard@ SV Gel and PCR Clean-Up System) 加50μl Membrane Binding Solution 于 50μl MDA 产物中, vortex后轻甩室温放1min,12000rpm 1 min? 加700μl Membrane Wash Solution,12000rpm 1min，弃液倒扣，注意不要交叉污染样本。 加500μl Wash Solution,12000rpm 1min? 12000rpm空转2min弃净多余液体,室温晾干3min? 加50μl无核酸酶水至离心柱膜上,将离心柱换到新的EP管上，室温放置5min后12000rpm离心1min,收集产物 DNA? 纯化后的产物检测 1、浓度:取2μl稀释至20μl,再取2μl用Qubit方法测浓度。 2μl 样本：198μl工作液；标准品10μl：190μl工作液（工作液1μl染料:199μlbuffer/样本）标准品1#和2#均需要配置。静置3min后测浓度。 2、 5对引物检测PCR反应体系： 名称体积2×PCR Master Mix12.5μlPrimer Mix8μl模板无法定浓度到60-180ng/μl每个样本取0.5μl水4μl－模板Total25μl5对引物检测PCR反应条件：【 】 反应温度反应时间循环数95°C5min195°C30s 4060°C30s72°C30s72°C10min14°C---Hold3、电泳:3%琼脂糖凝胶电泳检测,上样量约为10μl样本+3μl loading buffer?120V 15min。(5条带为标准，3条带亦可上机测序)。 文库构建 (用life Tech 的Ion Xpress Library Kit ) 一、DNA片段化: DNA起始量为120ng,取适量体积DNA于PCR管中,补水至35μl? Ion Shear plus 10X Reaction Buffer 和 Enzyme Mix II Vortex 混匀各 5s,瞬时离心后放置冰上? 加5μl 10X Reaction Buffer于PCR管中,吹吸10次左右混匀? 加入10μl EnzymeMix II,吹吸混匀,手指轻轻拨动混匀? PCR 仪上,37°C孵育 35min?【】(注意:严格控制反应时间) 孵育后立即加入5ul Stop Buffer,vortex彻底混匀,瞬时离心后置于冰上? 二、纯化 1、取出XP磁珠充分混匀并平衡到室温，取1.5ml EP管加99μl XP磁珠/管，将样本加入其中，Vo