2_1数据处理.pdf

????PCR?：实验要素 数据处理 陈云地 8008100192，021407 ?????????????? 2004年 1 内容提要 ? 实验要素 ? 绝对定量与相对定量 ? ????PCR?????????? ? 多重定量的数据处理 2 PCR?????????? ????PCR???????? ? 目标基因 未知样品 ? 产生标准曲线 标准品 ? 监控试剂、系统 阳性对照 ? 监控污染 阴性对照 ? 数据之间可比性 内对照(IPC) ? 校正操作误差 参比荧光(ROX) ? 降低定量误差 3-6复管 4 96-???????????? 阳性对照 标准品 阴性对照 未知检材 5 DNA???? ? 模板可以是DNA、cDNA或者质粒 ? RNA需要先反转录成cDNA；反应只能以cDNA为模板， 但是可以通过标准曲线或者相对定量直接定出RNA的数 量或者比例 ? DNA纯度： OD260/OD280=1.8，可以在1.6 ~ 2.0之间 =1.8: 纯DNA 2.0: RNA污染 1.6: 蛋白质/酚污染 ? DNA用量： 基因组DNA：0.1 ng – 1 ug，最好10-100 ng/rxn ? 来源：血样、组织等 ? 自己制备（血样：如蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提，酒精 /NaAc纯化） 6 RNA???? ? RNA用量：60 ng – 2 ug / RT-rxn； ? RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ? 来源：血样、组织、病毒等 ? 反转录：100 uL的反应体系可以将最多2 ug 总RNA反 转录成cDNA；如果总RNA2 ug，分开做复管 ? cDNA用量： 1-100 ng RNA反转录所得cDNA加 1 uL/rxn 7 标准品 log X O log(RT ? RB ) ? log RS CT = ? + log(1+ E X ) log(1+ E X ) ? 标准品用来生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系 ? 不要求： ? 数学关系是抽象的、普适的，不要求标准品与目标基因一定具有相 同的生物学意义 ? 所以，同一个片段可以使用，不是同一个片段也可以使用 ? 任何DNA片段，PCR产物、质粒、病毒的PCR片段等均可 ? 要求： ? PCR效率尽量接近，越一致误差越小 ? 同样条件下完成：同样的仪器、试剂、循环参数、同一次实验 ? 同样质量的模板、同样Tm值的引物和探针 8 标准品 ? 5点以上，已知浓度（相对定量）/拷贝数（绝对定量） ? 购买，或者自己制备 ? 制备方法：选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、 调整浓度、梯度稀释 ? CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 ? 10倍连续梯度稀释方法： 取1v标准品原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 取1v稀释的标准品(标准品ii)+9v稀释缓冲液，得标准品iii 取1v稀释2次的标准品(标准品iii) +9v稀释缓冲液，得标准品iv 取1v稀释3次的标准品(标准品iv) +9v稀释缓冲液，得标准品v 切不可由标准品i加不同体积的稀释缓冲液 直接得到标准品ii、iii、iv、v