日本血吸虫29000膜外蛋白的表达和纯化及功能初步鉴定.pdfVIP

为此，设计并合成?蕴匾煲?铮?’·型迥??????．基础实验诊断研究．??ね獾鞍椎谋泶锖痛炕?肮δ艹醪郊??自本血吸虫?????????’和??里￡曼垒鱼?????????任翠平刘淼赵志荣雷黎朱绍春王晓楠沈际佳工生物技术股份有限公司合成如下引物：??坏?塑竖???生堡捡堕匿堂盘壶??生鱼旦筮?鲞筮?峥羊?』??悦耍骸?些??：???好吮だ?随着血吸虫病防治工作的不断深入及血防形势的改变，血吸虫病流行的特点对本病的诊断提出了更高的要求。因表膜蛋白更易接触机体的免疫系统，刺激机体产生相对应的抗体，大多研究都支持虫体的表膜蛋白较其他蛋白有较好的诊断价值。本课题组将日本血吸虫????????泄?舐街????砟さ鞍椎哪ね馇??蛱逋庵刈椴⒈?达，纯化后初步鉴定其免疫原性和免疫反应性，希墨可用于日本血吸虫病的免疫诊断和疗效考核。一、材料??G謇丛矗杭毙浴⒙?院屯砥谌毡狙N?娓腥净颊呋?合血清各?份，采自安徽省日本血吸虫病疫区；健康人混合血清?份，采自安徽医科大学非流行区的健康新生儿。??目狻⒕?趾椭柿＃喝毡狙N?嬷泄?舐街晖????文库¨?杀臼夜菇ǎ淮蟪ΠＯ＞??甤??菌株?????、??和表达质粒???由本室保存，克隆载体????·????H毡綯????静?贰?二、方法???锷杓朴牖?蚶┰觯翰慰糃???等心。实验，并根据??????7旁亩量蛄蕉诵蛄校?杓撇⑺椭辽虾Ｉ???’，两条引物的??朔直鹨?胂拗菩阅谇忻窫?????盖形坏恪Ｒ匀毡狙N?嬷泄?舐街晖?鎐???库为模板进行常规??┰觥??胶回收产物与?靥辶?接并转化至感受态????，涂板，将阳性克隆进行???双酶切和??庑蚣?ā???塑账嵝蛄型?葱苑治龊突?蜃⒉幔翰庑蚪峁?ü?????腿隢???蚩猓??肂??程序进行核苷酸序列同源性分析，并将测序结果在基因库上登录。?甧??膜外融合蛋白的表达和??狿??治觯貉≡????????ね馇?被?崞?卧贓．??中表达融合蛋白。?????’和?利用这对引物以上述质粒为模板进行??┰觥??胶回收产物亚克隆入表达质粒???并转化至感受态??，将转化成功的重组菌接种到?／?液体培养基诱导表达，于诱导后??、??陀盏记傲粞??⑿蠸?．??鉴定。具体参照分子生物学实验指南”?椒ń?胁僮鳌??畆??膜外融合蛋白的纯化：蛋白在变性条件下过??亲和树脂层析柱，具体参照蛋白纯化试剂盒使用说明书。纯化产物进行????鉴定。?畆??膜外融合蛋白免疫印迹法??鉴定：方法参照文献??杂懈亩?Ｒ豢狗直鹞毙浴⒙?浴⑼砥谌毡狙N?虫患者血清和正常人血清??肞????稀释???刮????昙堑纳窖蚩谷薎??肞???∈?，化学发光显色，显色结果行灰度扫描。?畇??鞍锥嗫寺】固宓闹票负涂固宓男Ъ奂觳猓撼?规方法免疫小鼠。用间接????觳舛嗫寺】固宓男Ъ邸?三、结果?甋??刈橹柿５募?ǎ褐刈橹柿７直鹩肊????盖泻蚉?鉴定，产物用?デ碇?悄?旱缬炯觳猓??别得到长约???的片段，其酶切图谱与预期一致，如图?所示。?甋???蜃⒉幔航ú庑蚪峁?淙牖?蚩猓?瑽??软件分析，与??????腸??蛄型?葱晕??ィ?被?酸序列同源性为?％，因此作为一个新基因在基因库卜注册，并命名其为??，获得基冈赘录号????。?畆??膜外融合蛋白的表达和纯化：经????凝胶电泳检测，约?????飨缘奶匾煨缘鞍字是?????化后蛋白纯度达?％以上，因目的蛋白相对分子质量约???靥灞泶锏鞍资????食醪饺范????Φ牡鞍?分子为???ね馇?诤系鞍祝?缤?所示。??????基金项目：安徽省“十一五”科技攻关课题资助项目??????话不帐∪瞬趴7⒒?鹱手?钅???????作者单位：???合肥。安徽医科大学病原生物学教研窀通讯作者：沈际佳，电子信箱：?????????甤?????注：?瓺???标准带；?甌—???／???铮?．???／??物；?甌—???／??双酶切产物；?畃???疭???盖胁??图?刈橹柿５腜?和酶切鉴定???籘?瓹???琁?’?????????’。?·??? ．专家答疑．生堡捡坠医堂盘圭??至垒旦筮?鲞笠鱼捆垦垡??丛?耍骸?堡??：坠??核芾??畆??膜外融合蛋白的免疫学特性鉴定：纯化蛋白能够被急性、慢性和晚期日本血吸虫患者血清识别而不被健康人血清识别，如图??尽；叶壬?璧木还饷芏戎狄来挝???嗫寺】固宓男Ъ奂觳猓盒∈竺庖哐G搴兔庖咔把?清均按???～?????倍比稀释，间接????觳饨峁?显示小鼠免疫血清稀释到?，??比晕Q粜裕??庖咔把?清在???时已为阴性。四、讨论本研究参考文献????軸?篊????开放阅读框两端序列设计引物，通过??坝隩载体连接后，经???序并比对发现扩增产物与??????腸??蛄械耐?源性为?％，氨基酸同源性达?％。因此作为一个新基因在基因库上注册，并命名其为??，获得基因登录