第13章基因工程與PCR.pptVIP

生物化学CAI课件A;目录;学 习 目 标;第一节 基因工程;一、基因工程的相关概念; DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来 源的遗传物质—同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA与载体DNA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子—复制子(replicon)，继而通过转 化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细 胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，既 DNA克隆。由于早期研究是从较的染色体分离、扩增 特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(gene cloning)。 克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载 体分子所形成的复制子是杂合分子—嵌合DNA，所 以DNA克隆或基因克隆又称重组DNA。 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重 组DNA技术，又称基因工程。; （二）工具酶 在重组DNA技术中，常需要一些工具酶进行基因操作。 1·限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有1800种以上，常用的有几十种。现列举某些限制性核酸内切酶如下页表（其命名是根据含有该酶的微生物种属而定，如从淀粉液化芽孢杆菌H株分离出的第一种限制酶命名为Bam HⅠ）。;下表：限制性核酸内切酶; 续表：限制性核酸内切酶; 2·DNA连接酶 DNA连接酶催化DNA分子中相邻的5‘磷酸基和3’羟基末段之间形成磷酸二酯键 ，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片连接。 3· DNA聚合酶Ⅰ 其作用是：①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④填补3′末端 4·Klenow片段 又名DNA聚合酶Ⅰ大片段，具有完整的DNA聚合酶Ⅰ的 5→ 3聚合、 3 → 5外切活性，。常用cDNA于的合成，双链DNA 3末端标记等 5·反转录酶 其作用是： ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补、标记或DNA序列分析 6·多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化或 标记探针 7·末端转移酶 在3‘羟基末端进行同质多聚物加尾 8·碱性磷酸酶 切除末端磷酸???; （三）目的基因 应用重组DNA技术的目的是为获得某一感兴趣 的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达 产物—蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是 目的基因，又称目的DNA。目的基因有两种类型， 即cDNA和基因组DNA。 cDNA是指经反转录合成的 与RNA（通常指mRNA或病毒RNA）互补的单链 DNA。以单链cDNA为模板经聚合反应可合成双链 cDNA。基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整 套遗传信息（然色体及线粒体）的所有DNA序列。 目的基因又称外源DNA。; （四）基因载体 基因载体或称克隆载体，是为携带感 兴趣的目的基因、实现目的基因的无性繁 殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。可充当基因载体的DNA分子有 质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。它们 经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼 有表达外源基因的能力。 ; 所谓质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双 链DNA分子,小的2~3kb，大的可达数百kb。质粒分 子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞 内独立自主的进行复制，并在细胞分裂时保持恒定 地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会 赋予宿主细胞一些遗传性状，如对青霉素或重金属 的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的 存在，是筛选转化子细菌的根据。因此，质粒DNA 的自我复制功能及所携带的遗传信息在重组DNA操 作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。 ; pBR322质粒是稍早构建的质粒载体，其 DNA分子中含有单个EcoR限制性内切核酸酶 位点，可在此插入外源基因。此外还含有 ter γ和 ampγ两个抗药基因（分别为抗四环 素抗氨苄青霉素） 。这个质粒还含有一个复 制起始点（ori）及DNA复制调节有关的序 列，赋予pBR322质粒复制子特性（见下页图 示）。 常用作克隆载体的噬菌体DNA有λ噬菌 体和M13噬菌体。;pBR322质粒;二、重组DNA技术基本原理及操作步骤;下图：以质粒为载体的DNA克隆过程; （一）目的基因的获取