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浅析细菌内毒素检测方法及常见问题;内 容;一、细 菌 内 毒 素 简 介;主要来源 主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖，这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约在1~ 5纳米 。 细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100EU/ml。;主要特性（实验器材处理方法） 1.耐热性 一般在100℃加热1小时无影响，120℃加热4小时能破坏98％，180－200℃干热2小时或250℃干热半小时才能完全破坏。 故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。 2.不耐酸碱性 内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。 故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡;主要特性（实验器材处理方法） 3.水溶性与不挥发性 　 热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。 故：不可用湿热灭菌法处理实验器具 ;主要特性（去除内毒素方法） 4.滤过性 原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不能通过半透膜。 5.吸附性 能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。;热原=内毒素 ？ 热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。 但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。 ;热原检查方法简介 《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进行检查。 将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。 ;热原检查法;与热源对比内毒素检查法优势 方便、快捷、经济； 重现性好、灵敏度高； 避免抗原的产生，克服生物测定的误差； 近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源法;在药检中的应用 细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。 成品检查——药品安全性检查之一 半成品??生产过程）检查——事前质控手段，避免造成药品成批报废 ;二、细菌内毒素检测方法;鲎试剂与内毒素反应机理;名词解释1—鲎及鲎试剂;;名词解释2—国家标准品及工作标准品;名词解释3—细菌内毒素检查用水;细菌内毒素检测之凝胶法;实验材料及用具 1、仪器 ;试剂 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、75％乙醇 常用英文缩写 BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水 MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照 MVC：供试品最低有效浓度 PC：阳性对照 λ：鲎试剂灵敏度 L：供试品细菌内毒素限值;灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。 试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支； 待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：;;2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支，按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm×75mm），将试管按如下形状排列。 3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。;反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置37 ℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持完整为“－”。 当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc ： λc＝lg-1(∑X/4) （X:反应终点浓度的对数值。） 当0. 5λ≤λc ≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度λ为准。;左侧管旋转180°凝胶不能保持完整为阴性，记为“－”；右侧管旋转180°凝胶不变形为阳性，记为“＋”。;举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125