分子生物学研究技术-理论幻灯片.pptVIP

分子生物学研究技术;一般认为1973年是基因工程诞生的元年。 上世纪40年代——70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作。;1944年，Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验;40年代，证实DNA是遗传物质 早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和组蛋白构成，但组成蛋白的氨基酸有20种，而组成DNA的核苷酸只有4种，什么是遗传物质？ 1928年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。 （1）S型：注射小白鼠，死亡。 （2）S型，65℃ 加热：注射小白鼠，活。 （3）R型：注射小白鼠，活。 （4） 65℃ 加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。 ;40年代，DNA是遗传物质被证实 1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。 （1） S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌； （2）经DNase 处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。 （3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。 不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。;Watson 和Crick;50年代，DNA的双螺旋模型的提出 和DNA复制机理的阐明 ;;Nireberg等为代表的 一批科学家;60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则） ;Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内切酶。 ;1967年，世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。 ;1972年，美国Stanford大学的P. Berg 等首次成功地实现了DNA的体外重组；;1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。 这一年被定为基因工程诞生的元年。;Cohen等的重组实验示意图;基因工程研究的基本步骤;基因工程的基本流程;第二章 基因操作的工具酶;1、限制性核酸内切酶的分类合命名 2、II型限制性核酸内切酶的基本特性 3、限制性核酸内切酶的消化反应;限制性核酸内切酶的概念;限制性核酸内切酶的分类;限制性核酸内切酶的命名;II型限制性核酸内切酶的3大特点;与II型核酸内切酶有关的几个概念;几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点; 一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，50?L反应体系中完全降解1 ?g ? DNA所需要的酶量。 影响酶活性的因素很多，最重要的有： A. DNA的纯度和甲基化程度 B. 甘油的含量（不超过5%） C. 反应体系中的离子强度 D. 反应体系的pH值 F. 反应的温度条件 （通常为37℃ ）;酶 切 反 应 的 基 本 步 骤;1、DNA连接酶作用的特点 2、DNA连接酶的反应条件;DNA连接酶作用的特点;DNA连接反应的条件;粘性末端DNA片段的连接;1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 ; 大肠杆菌DNA聚合酶I （E。Coli DNA pol I）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力： 5′- 3′聚合酶活性 以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。 5′- 3′外切酶活性 将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。 3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。;1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 ; Klenow片段的主要用途;第三章 基因克隆的载体;引 言;Characteristics of vectors for gene cloning;第三章 基因克隆的载体;第一节 质粒载体 （plasimid vectors）;1.质粒载体的生物学特性;1.质粒载体的生物学特性;1.质粒载体的生物学特性;1.质粒载体的生物学特性;第一节 质粒载体 （plasimid vectors）;质粒：是一种裸露的双链闭环DNA分子，它们在寄主细胞中能够独立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。;多克隆位