生物技术综合实验(二)选编.ppt

;理论内容部分;;一、超氧化物歧化酶;超氧化物歧化酶的来源;发展历史;超氧化物歧化酶的作用机理;二、SOD用途及前景;超氧化物歧化酶的应用;药物类 　　主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者； 用于生化制药 　　作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，具有极强的抗衰老，抗肿瘤、 调节人体内分泌系统作用；;用于化妆品类 　　可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。 有减少皱纹、祛斑的功效以 SOD为主要成份的产品风靡世界，引发了化 妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真； 用作保健食品、饮料 　　如SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销! 在饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统;总之，超氧化物歧化酶可以清除体内过量的自由基，提高人体免疫力，延缓衰老；有效降低血脂、胆固醇、血压； 抗疲劳，增强肝肾功能；抗辐射；对糖尿病有明显的恢复作用；调节女性生理周期，推迟更年期 。;应用前景; 可以预言,随着人们对SOD 更广泛深入的研究,不同类型SOD、SOD 修饰物及人工有机合成SOD 模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用.;;;;实验部分(P40-70）;一、基本内容： 细胞破碎及酶的抽提。 两种蛋白质含量测定方法及酶的活力测定。； 离子交换柱分离操作及分析。 SDS电泳测定蛋白质分子量。 固定化酶的制备技术。 6. 酶的柱层析分离操作，包括装柱，恒流泵及部分收集器的试调，上样，洗脱等。 7. IEF测蛋白质PI； 8. POD同工酶分析； 9. 细胞器的分离及其标志物（酶）的测定 ;二.目的要求 ;三.基本原理 ;　　本实验从血中提取SOD，提取液经葡聚糖凝胶柱上层析，分离出SOD，然后用邻苯三酚法测定其酶活力。邻苯三酚在自氧化过程中产生有色中间物（红桔酚）和O2-,使溶液颜色变褐加深。加入SOD能歧化O2-阻止中间物（红桔酚）的积累，通过分光光度计比色分析反应液的颜色而测定其酶活力。;;;去血红蛋白; 1.热变性 原材料的预处理中获得的上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液。 2.沉淀 清夜在冰浴中冷却，然后在-5℃一下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2~3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液 ;三．材料器具 ;4. 试剂的配法 （1）pH8.2、50mmol/L?Tris-HCl  称取Tris?0.61g，EDTA-2Na?0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH?=8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。 （2）10mmol/L?HCl （3）50?mmol/L邻苯三酚 称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L?HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。 （4）SOD样液 ;四.实验操作 ;（二）SOD的凝胶层析分离纯化 ;2．装柱： （1）将层析柱竖直固定于支架上,连接好恒流泵、部分收集器,调节洗脱液的操作压60cm。（2）先向层析柱中加入1/3高度的pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液,然后用大口进样器吸取上述准备好的凝胶徐徐注入柱中缓冲液内,让其自然沉降，沉降好的柱床顶部离管口1—2cm为宜。若高度不够，可放去部分缓冲液，搅起管中凝胶界面，继续添加凝胶。（3）装毕，用2—3个床体积的洗脱液洗脱，以使床柱稳定。;; 3．上样： ;5．洗脱液酶蛋白含量的测定： ;（三）SOD酶活力测定; 邻苯三酚自氧化法原理： ;　　　　　　　 邻苯三酚─────── O2?- + 红桔酚 　　　（自氧化：有色物质积累，吸光值增加） 　　 　O2?- + O2?- +2H+────H202+O2 　　　（SOD催化：阻止中间产物积累，吸光值降低） ;实验步骤：;2.SOD样液活力测定： 　样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，在 25℃水浴锅中保温10min，再加入预热的邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定 。 ;3. 数据处理;3.2 SOD酶活力计算： (酶活力单位定义:在一定条件下,每1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚