细胞培养必备识知点.pptVIP

细胞培养技术;细胞培养 cell culture 是从体内取出组织的单个细胞或单一细胞群模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并保持细胞特性，为细胞培养。 ;各种液体要专人配制，并保证做到按规程行事；制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。;培养用品要有固定的存放地点（培养用品与非培养用品存放分开；已消毒与未消毒品严格分开存放）， 目的：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞“污染”。;二、细胞生存条件及代谢;无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。 细胞被置于体外培养后，失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。; ; ; ;二、实验设备;三、在肿瘤学中的应用; ; ; ; ;细胞培养：;一 原代培养;原代培养（primary culture） 从体内取出组织或细胞的第一次培养;原理 ? ? 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA乙二胺四乙酸）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 ;仪器、材料及试剂 ? ? 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） ? ? 材料：动物组织块 ? ? 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒;初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。;5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 ;初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 ;二. 传 代 培 养; 原理 ? ? 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 ;材料和试剂 1. 细胞：贴壁细胞株 2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等? ?;二. 传 代 培 养;换液;准备事项;6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培瓶口， 来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出， 烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取5ml-8ml的培养基打入