蛋白质的方法与原理试题.pptVIP

第十章 蛋白质的研究方法与原理;第一节 概 述; 蛋白质的分离纯化包括以下过程： 1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; （盐析法或有机溶剂法） 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开； 4.蛋白质结晶； 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。; 制备过程中注意事项： 要求自始至终保持在天然状态 避免一切过激因素--如过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。 2. 通常都在低温条件下操作。 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。 ;第二节 蛋白质的分离与纯化技术;一、蛋白质沉淀与结晶 ; （一）盐析法 概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。 优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低; （1）盐的种类 对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力 也愈强: PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞ AC－＞CL－＞NO3-＞Br -＞I-＞CNS- K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+ 常用的中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。;硫酸铵（常用盐析剂） 优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。 缺点：缓冲能力较差 PH难控制 ;（2）PH和温度 S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度 除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响: PH=PI时，S。的数值极小 S。随温度增加而减低。 盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出。; （3）蛋白质浓度 [Pr]较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。 [Pr]较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。;1.基本原理 （1）在PI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了 中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。 （2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也 促使Pr变得不稳定而聚集析出. 常用的有机溶剂：乙醇和丙酮 ;（三）选择性沉淀法 ;（四）蛋白质结晶 ;二、离心技术分离蛋白质 ;三、层析技术分离纯化蛋白质; 气相层析 按两相状态来分 液相层析 吸附层析 分配层析 离子交换层析 按层析机理来分 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 按操作方式来分 薄层层析 纸层析; （一）凝胶过滤层析 又称分子筛或凝胶过滤（gel filtration） 原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。; 离子交换层析法 *原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相） 填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。;