乙醇脱氢酶的克隆表达及酶活优化.pdfVIP

中国医药生物技术 2015 年 8 月第 10 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2015, Vol. 10, No. 4 361 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.04.018 ·论著· 乙醇脱氢酶的克隆表达及酶活优化 黄飞，奚超群，黄艳花，陈建华，胡磊 【摘要】 目的 构建表达重组粗糙脉孢菌乙醇脱氢酶的工程菌，并对 乙醇脱氢酶酶活测定条件进行优化，为氧化还原酶酶法催化 在手性药物中间体合成中的应用提供指导。 方法 采用 PCR 技术，以粗糙脉孢菌基因组 DNA 为模 板，克隆得到粗糙脉孢菌乙醇脱氢酶基因，连接到表达载体 pET-28a 上，得到重组质粒 pET-ADH。将该重组质粒导入 大肠杆菌 BL21 中，并经培养、筛选、酶切、测序鉴定。 用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并测酶活力， 同时对影响酶活的条件进行研究。 结果 粗糙脉孢菌乙醇脱氢酶活力较高，最适反应介质为 Tris-HCl 缓冲液，在 30 ~ 35 ℃、pH 7 ~ 8 时酶活力较稳定， 较适底物为 2-氯苯乙酮。 结论 通过采用 PCR 技术，成功克隆表达粗糙脉孢菌乙醇 脱氢酶，并优化得到最优酶活条件。 【关键词】 醇脱氢酶； 粗糙脉孢菌； 克隆； 酶活 优化 中国医药生物技术, 2015, 10(4):361-365 生物催化，即利用某种生物材料（主要是酶或 微生物）来催化进行某种化学反应，正在快速地发 展成为一种构建技术，尤其是在以化学、区域和立 体选择性反应为关键性反应的制药工业中[1]。在重 要化工制备中，生物催化具有重要应用价值，尤其 是手性药物中间体的制备，已经应用于常规工业化 过程的反应包括酯酶/脂肪酶和蛋白酶对底物的手 性拆分和水解，酮的不对称还原等[2]。 乙醇脱氢酶是一种含锌金属酶，其活性位点含 有两个反应性巯基以及一个组氨酸残基，需要 NAD（H）、NADP（H）作辅酶转移电子进行催化 反应[3-5]，是催化醇类代谢初始反应的重要酶[6]，在 生物催化、生物医学领域应用广泛。研究表明乙醇 脱氢酶不仅可逆地催化氧化短链醇、芳香醇等为相 应的醛类或酮类[7]，而且可在温和的反应条件下， 将含有甲基、乙基、叠氮基、氰基、氯甲基等基团 的大体积酮或酮酯选择性氧化还原成相应的单一 手性醇类[8-10]。由于乙醇脱氢酶的特殊催化作用， 其被广泛应用于工业生产中[11-14]。商品化的乙醇脱 氢酶多来自于酵母和粗糙脉孢菌，本文利用蛋白重 组技术在大肠杆菌中表达乙醇脱氢酶，并考察其最 佳酶活条件，为后续的工业化应用提供技术支持。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及质粒 载体质粒 pET-28a、大肠杆菌 DH5α、表达菌株 BL21(DE3)pLySs 由南宁信肽生 物技术有限公司保存；粗糙脉孢菌菌株购于中国微 生物菌种保藏中心。 1.1.2 试剂 T4 连接酶、内切酶（Not I、Nde I）、 pfu 酶、DNA 提取试剂盒/胶回收试剂盒等均购自 大连宝生物公司；HisTrap 预装柱购自美国 GE 公 司；BCATM Protein Assay Kit 购自美国 Pierce 公 司；酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、琼脂、IPTG 诱导剂、氯霉素、卡那霉素等购自上海生工公司。 1.1.3 仪器 9700 PCR 仪为美国 ABI 公司产 品；GelDoc XR 凝胶成像仪为美国 Bio-Rad 公司 产品；Agilent_1200 型高效液相色谱仪为美国 Agilent 公司产品；恒温培养箱、摇床、脱色摇床 均为上海一恒仪器有限公司产品。 1.2 方法 1.2.1 基因组提取 按照基因组 DNA 提取试剂 盒说明提取。①取 1 ~ 5 ml 菌液，12 000 r/min 离 心 1 min，尽量吸净上清，向菌液沉淀中加入 180 μl 溶解缓冲液和 20 μl 蛋白酶 K，振荡至菌体彻底 悬浮。55 ℃ 水浴孵育 45 min。12 000 r/min 离心 5 min，转移上清至一无菌离心管中。②加入 10 μl 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）于裂解液中，立即涡 旋混合 5 s。加入 200 μl 结合缓冲液，立即涡旋混 合 5 s，70 ℃ 孵育 10 min。加入 200 μl 无水乙醇 于裂解物，涡旋混合 5 s。将全部的溶液加入吸