第五章凝胶层析选编.ppt

第五章 凝胶层析(Gel chromatography);;;凝胶层析 gel-filtration chromatography;凝胶层析的基本原理;凝胶层析的特点 ;4．应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102～105Da；Sepharose类为105～108Da。;5．分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。;分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度都快。 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度都慢。;2 凝胶介质的基本性质;葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升。 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解。 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温。 Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤 。;12; 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比 ）。 当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。; 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（ 数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）。;凝胶介质的选用原则; 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离。 该策略也是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。 ;凝胶层析的基本操作;上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：;*;*;*;*; 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;第三节 凝胶层析的实验条件和操作 ;*;*; 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。 ; 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。—般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。; 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后