检验的技术化学发光-荧光免疫的技术-仪器.pptVIP

第十一章 化学发光和荧光免疫技术及仪器;第一节 化学发光免疫分析技术 第二节　电化学发光免疫分析 第三节　时间分辨荧光免疫分析法 第四节　荧光偏振免疫分析法 第五节　化学发光免疫分析的临床应用;教学目标和要求 掌握化学发光免疫分析技术的基本原理、反应的底物和标记方法以及反应类型。 熟悉电化学发光免疫分析的基本原理和标记物，时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯合物。 了解荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点，化学发光免疫分析的临床应用 ;第一节 化学发光免疫分析技术;一、基本原理;(一)产生化学发光反应的条件和过程;(二)化学发光效率;(三)强度与反应物质浓度之间的关系;(四)化学发光的反应类型;2．间接化学发光(敏化的化学发光 ) ;二、反应的底物(发光剂或发光底物) ;;三、标记方法;按照被标记物的结构或性质 :;按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点: ;;常用的标记方法 ; 2．重氮盐偶联法(又称重氮化法) ;3．过碘酸盐氧化法 ;4．戊二醛法 间接偶联;5．琥珀酸酐法(环内酸酐法) ;6．异硫氰酸酯衍生物法 ;7． O-(羧甲基)羟胺法 ;四、反应类型 ;1.化学发光免疫分析; 1)直接化学发光使用吖啶酯(AE)作为标记物，无需附加催化剂。AE氧化直接发光，氧化反应在430 nm处快速发光并在1s内达到峰值。发光强度是I125在1min内发光强度的十万倍，因此系统该具有高速度、产光强等特点。 2)AE有甲基，增加了试剂的稳定性，使试剂的稳定性好，有效期更长。 3)AE作为化学发光标记物，对温度及pH等外界环境的变化不敏感，故其具有很高的精密度。 4)AE相对分子质量水常小(MW：481)，使其对结合反应的空间位阻作用减少，增加扩散率，提高了灵敏度，可达l0-15mol·L-1。 5)AE是以共价键结合抗体而不影响抗体结合抗原的反应，故不影响发光。 6)AE加碱后，发光是在一暗盒中进行，其光量值与浓度有着良好的线性关系，且本底较低。;2．化学发光酶免疫分析;常用标记物:;3．微粒子化学发光免疫分析 (microparticle chemiluminescence immunoassay，MLIA) ; AMPDD一侧的芳香基团上的磷酸酯???水解，失去一个磷酸基而生成一个中等稳定的中间体AMPPD(半衰期2～30min)，此中间体通过内部电子转移而裂解为一分子的金刚烷酮和一分子激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当回到基态时发出波长为470 nm的光);常用标记物:;五、相关仪器介绍;(一)ADVIA CENTAUR检测原理 ; (二)ADVIA CENTAUR的反应类型;2．竞争法 包括AE标记抗原法和AE标记抗体法。;3．捕获法 常用来检测样本中的特异性抗体，又称为抗体捕获法。 ;第二节　电化学发光免疫分析;一、基本原理;技术特点 ;二、标记物;第三节　时间分辨荧光免疫分析法; 用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物(代替荧光物质、放射核素或酶)，通过双功能基团的螯合剂与蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞以共轭双键结合进行标记，待反应体系(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后，三价稀土离子螫合物可以在紫外光激发下，发出强度高(波长为613nm左右)、持续时间长(10～l 000μs)的荧光，利用延缓测量时间，待样品中蛋白质等背景荧光完全淬灭后，再测量三价稀土离子螯合物的特异荧光，根据荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的???的 ;时间分辨技术消除背景荧光: 在检测样品中，含有各种蛋白质和其他化合物，这些物质在较大波长范围内都可产生自发荧光,寿命短. 镧系离子荧光寿命很长（10us～1.0ms），比背景荧光长3～4个数量级。所以应用荧光的时间分辨技术在背景荧光已经降到很低时再开始检测稀土鳌合物的荧光，从而消除了非特异性荧光的干扰。;二、标记物和螯合剂;三、方法分类 1．按反应类型分为固相竞争法和非竞争法(双抗体夹心法)。 2．按是否加入增强液分为两大系统，需要加入增强液的，以瑞典LKB公司的Arcus TRFIA体系为代表；不需要加入增强液的，以加拿大Cyber Fluor TRFIA体系为代表。;第四节　荧光偏振免疫分析法;第五节　化学发光免疫分析的临床应用 (一)甲状腺疾病相关免疫检测 (二)生殖内分泌激素检测 (三)贫血的检测 (四)肿瘤标志物的检测 (五)心肌蛋白的检测 (六