妊娠子宫肌中促肾上腺皮质激素释放激素受体的分析的论文.docVIP

　　妊娠子宫肌中促肾上腺皮质激素释放激素受体的分析的论文 【关键词】 妊娠　　人类妊娠是一个复杂而又需机体各部分协调运转的过程。子宫肌层由静息到收缩的机制很复杂，目前还在探索中。妊娠期众多激素的变化引起人们广泛的关注，其中促肾上腺皮质激素释放激素（crh）近年来成为人们关注的焦点。 　　crh是脑肠肽家族中的一种，于1955年最早发现于下丘脑室旁核，之后在许多外周组织中，如免疫和炎症细胞、心脏、骨骼肌、甲状腺、皮肤、生育组织中发现了它的存在［1～3］。胎盘是妊娠期母体crh的主要来源。人们发现母体血浆crh水平随着妊娠继续而逐渐升高，分娩前达到高峰，产后迅速下降；早产患者的crh峰较正常妇女提前，提示母体血浆crh水平与分娩密切相关［4］。crh可能通过与雌激素、肾上腺皮质激素、前列腺素和缩宫素等的相互作用，建立分娩启动的正反馈环［2，5］。在妊娠子宫宫底部crh发挥收缩作用，而在下段舒张子宫平滑肌，这可能与受体和（或）传导通路不同有关［6，7］。本研究通过对子宫下段平滑肌层中crh受体和（或）亚型的研究，进一步揭示crh在分娩过程中的作用机制。 　　1 对象与方法 　　1.1 研究对象 （1）宫缩组：随机抽取足月因产科因素行剖宫产、已有宫缩者，排除合并恶性肿瘤者，共15例，平均27.55（24～36）岁。（2）无宫缩组：随机抽取足月因产科因素行剖宫产、无宫缩者，排除合并恶性肿瘤者，共14例，平均30.64（25～41）岁。（3）未妊娠组：随机抽取因子宫肌瘤行子宫切除患者，排除合并恶性肿瘤者，共15例，平均46.59（40～54）岁。. 　　1.2 主要试剂与仪器 无水乙醇（上海试剂一厂），三氯甲烷、异丙醇（中国医药上海化学试剂公司），焦炭酸二乙酯（depc）、trizol（上海华舜生物公司），dntp、oligo(dt)（上海生工生物工程有限公司），m-mlv反转录酶、tap dna聚合酶（promega公司），核糖核酸酶抑制剂（takara公司），milli-q纯水制备装置（millipore公司），pcr仪（eppendorf公司），dna电泳槽（l加depc 1ml，37℃摇动过夜，然后高压灭菌。（2）75%酒精：125ml depch2o加 375ml无水乙醇，混匀至终体积500ml。（3）50×tae电泳缓冲液：tris 242g、100ml 0.5mol/l edta（ph=0.8），加冰醋酸57.1ml，用蒸馏水定容至1000ml，临用前按需用蒸馏水稀释成1倍的工作液。 　　1.4 研究方法 　　1.4.1 子宫标本的收集 （1）于子宫下段切口正中上缘切取适量新鲜子宫肌层标本放入经过depc水处理的10ml离心管（冰中）内；（2）每个离心管内加入2ml trizol；（3）于1h内用电动匀浆机匀浆（冰浴中操作），26000rpm持续15s以彻底裂解组织；匀浆液于-80℃保存，待提取rna。 　　1.4.2 总rna的提取及浓度测定 （1）总rna的提取：按照上海华舜生物公司trizol reagent操作说明书进行。①室温溶解组织匀浆液：将组织匀浆液1ml移至1.5ml离心管，室温静置8min；②各管加入0.2ml三氯甲烷；③用力颠倒混匀，室温静置8min；④4℃，12000×g离心15min；⑤将上清液小心移至另一个1.5ml离心管；⑥各管加入等体积异丙醇，振荡，室温静置10min；⑦4℃，7500×g离心15min；⑧小心弃上清液，各管加入75%乙醇1ml；⑨充分洗涤，4℃下7500×g离心10min；⑩弃上清液，空气中干燥15～20min；各管加入20μl depch2o溶解rna。（2）总rna纯度和浓度测定：采用紫外分光光度法，测定rna样品在波长260nm和280nm的紫外吸收值。根据od260为1时相当于rna 40μg/ml确定rna的量，根据od260/od280的比值来判断rna样品的纯度，比值位于1.8～2.0之间视为rna纯度优良。总rna抽提后，行rna甲醛变性凝胶电泳，观察18s、28s rna的完整性及二者比例，来判断rna的完整性。 　　1.4.3 rtpcr方法 （1）反转录（reverse transcription,rt）：按照promega公司反转录酶mmlv操作说明书合成cdna第一链：①取2μg总rna和1μg oligo（dt）分别放入同一个1.5ml离心管中；②70℃水浴5min；③冰上急冷3min；④各管分别加入10mm dntp 1.25μl、mmlv 1μl、rna酶抑制剂0.75μl、反转录缓冲液5μl；⑤用depch2o补齐至总体积为25μl，震荡、混匀后，离心；⑥42℃水浴60min；⑦70℃水浴15min；⑧-20℃保存备用。（2）pcr反应：利用