家族性帕金森病一家系的临床特征及PARK1基因突变分析的论文.docVIP

　　家族性帕金森病一家系的临床特征及PARK1基因突变分析的论文 【摘要】 目的 探讨一帕金森病(pd)家系的临床特征及进行park1基因g88c(位于3号外显子)、g209a(位于4号外显子)突变分析。方法 该家系祖籍为吉林省白山市，汉族，可追溯4代25人，其中9例发病(3人已去世)，4人可疑。家系图谱分析为一常染色体显性遗传大家系，总结该家系发病的临床特征。采家系成员外周抗凝血提取基因组dna，利用聚合酶链限制性长度多态性分析(pcrrflp)技术检测park1基因第3、4号外显子是否存在突变。所得产物利用琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析系统进行分析。结果 该家系有典型pd临床表现，且具有发病年龄早、发病成员临床症状相似等特点。采集的所有血标本的扩增产物分别经mvai和nmuci酶切后未见小分子片段，未发现g88c、g209a错义突变。结论 该家系为以震颤及强直为主要临床特征的常染色体显性遗传pd大家系，该家系不存在park1基因错义突变。有待于进一步查找该家系的致病基因。 【关键词】 帕金森病;家系;基因;限制性片段长度 近年来的研究表明帕金森病(pd)的发病具有遗传学基础，随着家族性pd致病基因的相继定位与克隆，分子遗传学在pd发病机制中的作用越来越受到关注。家族性pd虽少见，却为研究pd的遗传因素提供了极好的机会和条件，为探索pd的发病原因及新的治疗方法提供思路。park1(αsynuclein)是首先被发现的与遗传性pd有关的基因，已有两个点突变g88c和g209a被确认。.目前关于park1基因突变在我国大的pd家系中的研究报道较少，尤其是在北方的家系研究中未见，本文对搜集到的一个北方pd常染色体显性遗传大家系进行研究，筛查是否存在park1的g88c及g209a错义突变。 　　1 资料与方法 　　1.1 家系资料 该家系祖籍为吉林省白山市，汉族，可追溯4代25人，其中9例发病(3人已去世)，4人可疑，呈常染色体显性遗传模式。见图1。pd临床诊断依据2006年中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组制定的pd诊断标准。该家系发病成员起病年龄为20～40岁，具有典型pd症状，均以震颤及强直起病，伴有不同程度的pd非运动症状，无明显智能减退，口服左旋多巴治疗有效，症状逐年加重。先证者女性，1951???出生，于1997年于吉林大学第二医院神经内科确诊为pd。查体(服息宁控释片50/200半片后1 h)：血压110/70 mmhg，面部表情僵硬，双腕部张力呈齿轮样增高，双上肢肌张力轻度铅管样增高，双下肢肌力铅管样增高，以右侧肢体为重。走路协同动作减少，前驱前倾体姿。病理反射阴性。常规生化检查未见异常，头部mri未见异常。共搜集6名已发病患者的临床及血液样本资料，并搜集家系成员12例血液样本。 　　图1 帕金森病一家系图谱 　　1.2 方法 　　1.2.1 dna提取 所有家系成员均取肘静脉血8 ml枸橼酸钠抗凝，采用takara全血基因组dna提取试剂盒提取白细胞基因组dna。 　　1.2.2 聚合酶链反应(pcr) park1 3、4号外显子pcr引物序列均参照polymeropoulous文章〔1，2〕。见表1。引物均由上海sagon公司合成，反应体系含：50 ng/μl gdna 2.0 μl，100 μmol/l dntp 2.0 μl，50 ng/μl引物各1.0 μl，10×pcr缓冲液(含mgcl2)5 μl，taq酶0.2 μl，加ddh2o至50 μl，10×pcr缓冲液和taq酶均由takara公司生产。pcr反应条件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，外显子3 49℃(外显子4 55℃) 30 s，72℃ 40 s，共30个循环;72℃ 延伸6 min。以1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(eb)染色，在紫外灯下观察结果，并用takara pcr产物纯化试剂盒对产物进行纯化，利于酶切反应。表1 扩增park1 3、4号外显子片段所用引物序列 　　1.2.3 限制性片段长度多态性分析(pcrrflp) pcr纯化产物各取20 μl，分别用限制性内切酶mvai(外显子3)及nmuci(外显子4)在37℃恒温下酶切4 h(两种限制性内切酶产地为mbi)，产物以1%琼脂糖凝胶电泳，eb染色，凝胶成像系统下观察结果并摄像。若存在g88c突变，外显子3产物可被mvai酶切为136和56 bp两个片段;若存在g209a突变，外显子4产物可被nmuci酶切为128和88 bp两个片段。 　　2 结 果 　　18名家系成员(包括已发病的成员)的dna模版，经pcr 　　扩增后均获得了192 bp及216 bp的产物，所有产物分别经过mvai(外显子3)及nmuci(外显子4)酶切后均未获得切开片段。见图2