六章节目基因克隆及基因文库构建.pptVIP

第六章目的基因的克隆与基因文库的构建;从生物体基因组中分离克隆目的基因，是分子克隆技术获得应用的前提。进而，才能对目的基因进行如下研究： 确定其表达调控机制和生物学功能； 建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）； 将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。;一般来说，目的基因的克隆策略分为两大类： 一类是利用PCR扩增、化学合成等技术体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 另一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆。 鸟枪法构建基因组文库 cDNA法构建cDNA文库;目的基因克隆 基因分离的物理方法 鸟枪法 cDNA法 PCR法 化学合成法 基因文库的构建 鸟枪法 cDNA法;一、目的基因的克隆;（一）基因分离的物理方法;用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与一般基因大小相当的DNA片段（1000 bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌（如：E. Coli）中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出目的基因。;1.鸟枪法克隆目的基因的基本策略;2.鸟枪法克隆目的基因的基本步骤;3.鸟枪法操作的改进;例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。;冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法;13;4.鸟枪法克隆目的基因的局限性;（三）cDNA法克隆目的基因;1.cDNA法克隆目的基因的基本策略;反转录酶：AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒） MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和随机引物 Oligo（dT）引导的 cDNA 合成 是指 Oligo（dT）引物与 mRNA 3‘ 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为普遍，其缺点是由于 cDNA 末端存在较长的 poly（A）而影响 cDNA 测序。 随机引物引导的 cDNA 合成 采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5 端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。;（2）cDNA第二链的合成 ;DNApol dNTPs;dCTP;（3）双链cDNA的克隆 ;22;（1）完备分离程序 ;（2）特异分离程序 ;（3）差异分离程序 ;;3.cDNA法克隆目的基因的局限性;（四）PCR法克隆目的基因;PCR技术反应周期包括三个步骤： 高温变性：通过加热使得复制双螺旋DNA变性分离为单链，作为模板。（91℃，1分钟）。 低温退火：（约50℃，1分钟）使专门设计的一对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模板DNA两端的互补区段互补结合。 适温延伸：将反应混合物的温度上升到72℃，保温1分钟。;;31; PCR原理图 ; 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆。 ;（五）化学合成法克隆目的基因;1.化学合成法的基本策略;②补丁延长法： ;③大片段酶促法： ;上述三种方法各有利弊： 化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高； 在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。例如，每聚合一个单体的产物收率为95%，则合成50个碱基的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。;;某段连续的氨基酸序列所有可能的DNA序列 ;;化学合成的单元操作;3.基因化学合成的优点 可以合成细菌偏爱的密码子 可以定向改变个别氨基酸 可以在两端加上需要的限制酶切点 可以通过自动化仪器合成;;二、基因文库的构建;1.基因文库的基本概念;（2）基因文库构建的基本策略;;;（4）基因文库的完备性;（5）基因文库的质量标准;（1）基因组DNA的制备;（