生物大分子分离与提取实验教学方案.docVIP

PAGE  PAGE 4 生物大分子分离与提取 实验教学方案 实验一 鸡蛋黄中卵磷脂的分离、纯化与鉴定 实验目的： 了解从生物组织中提取生物分子的一般原理和方法 掌握从鸡蛋黄中提取卵磷脂的原理和方法 掌握卵磷脂的鉴定方法 实验材料、药品与设备： 鸡蛋，水浴锅，真空泵，蒸发皿，试管，研钵，氢氧化钠，硫酸铜，乙醇，丙酮，氯仿 实验原理： 卵磷脂是生物膜的成分，具有多种生物功能，鸡蛋黄中卵磷脂含量高达8%。卵磷脂、脂肪都溶于乙醇，而蛋白质、脑磷脂等在乙醇中形成沉淀，因此用乙醇溶液将蛋黄分成两部分。卵磷脂溶于氯仿而不溶于丙酮，因而可用丙酮将卵磷脂沉淀。 实验步骤： 1．卵磷脂的提取： 第一步：1个鸡蛋，煮熟，取蛋黄，研钵中研细，加95%乙醇15ml，再研磨，搅拌均匀。减压过滤，收集滤液。残渣移入研钵内，再加同量乙醇，研磨，过滤。将两次滤液合并。（注意：滤液应当完全透明） 第二步：将滤液集中到蒸发皿里，将蒸发四置于沸水浴上以蒸发掉乙醇，得到黄色油状物（注意：属于脂类混合物）。 第三步：冷却后，加入2-3 ml氯仿，搅拌使溶解（注意：各种脂类都溶解于氯仿）。 第四步：边搅拌边加入10-15 ml丙酮，卵磷脂析出。搅动使其粘附于玻棒上，溶液倒入回收瓶内。（注意：所用技术为有机溶剂沉淀法） 2. 卵磷脂的鉴定 （1）卵磷脂的水解：将卵磷脂转移到试管内，加入5 ml 10%氢氧化钠溶液，放入沸水中加热10 min，用玻棒搅拌，卵磷脂水解。冷却后，在玻璃漏斗中用棉花过滤。收集滤液备用。 （2）脂肪酸的检查：取棉花上的沉淀少许，加5ml水，搅拌，有何现象？过滤，滤液中加入浓硝酸，再滴10%醋酸铅溶液，观察有何现象？ （3）甘油的检查：取小试管一支，加入1滴5%硫酸铜溶液，2滴10%氢氧化钠溶液，振荡，产生氢氧化铜沉淀。再加入水解液，沉淀溶解，得深蓝色甘油铜溶液。 （4）胆碱检测：取1ml水解液，滴加浓硫酸，至中和（用蓝色石蕊试纸检查），然后加克劳特试剂1滴，产生夸红色沉淀。 （5）磷酸的检查：取1支试管，加入10滴水解液和5滴95%乙醇溶液，再加硝酸使其酸化，然后加入1ml钼酸铵试剂，观察有何现象产生？最后直接用火加热5-10min，观察黄色磷钼酸铵沉淀的生成 作业： 撰写实验报告（长度2000字以上） 实验二 奶粉中酪蛋白的检测 实验目的： 了解奶粉中的酪蛋白特点 掌握奶粉中蛋白质的提取方法 实验原理： 酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。 酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。 实验步骤： 1.酪蛋白等电点沉淀　　将10g奶粉溶解到100ml水中，在500ml烧杯中进行。加热至40℃左右，再慢慢加入同温度的乙酸钠缓冲液以调节酸碱度，直到pH达4.6左右，用pH试纸或酸度计调试。将上述悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤，收集沉淀。 2.除脂类杂质　　将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30ml95%的乙醇中。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合液洗涤沉淀两次，最后再用乙醚洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移到到表面皿，在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。 3.计算　　准确称重后，计算出每100g奶粉所含有的酪蛋白量。或者：100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量（g%），并与理论产量（3.5g%）相比较，求出实际获得百分率。 作业： 做出实验报告（长度2000字以上） 实验二 果汁中糖的检测 实验目的： 了解薄层色谱法的分离原理 掌握薄层色谱法鉴定果汁中的糖的操作技术。 实验原理： 对多组分的复杂混合物，无论是有机物或无机物，薄层色谱法是有效的分离技术之一。 硅胶是常用的吸附剂，在一定条件下，硅胶对各种糖分的吸附能力不同。同时，选择适当的展开剂，利用各种糖分的分配系数的差异，可能达到分离的目的。显色后得到的色谱图与已知糖分的色谱图比较，即可鉴定果汁中的糖分。 未知物组分的鉴定是通过在同一块薄层板上分别点上标准样品和未知样品，通过比较斑点的比移值来定性鉴定。 比移值公式：Rf=原点到斑点中心的距离/原点到展开剂前沿的距离 相同条件下，物质的Rf值是一定的，因而可用其作为定性分析的参考。分离后，可能用适当的方法定量测定。将被测物浸取后用比色法测