复元胶囊对软骨细胞凋亡P38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的影响的论文.docVIP

　　复元胶囊对软骨细胞凋亡P38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的影响的论文 【摘要】 目的： 观察复元胶囊含药血清对体外培养软骨细胞凋亡及p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路（p38mapk）的 影响 . 方法 : 建立体外原代软骨细胞培养体系,制备复元胶囊含药血清,采用硝普钠（snp）诱导软骨细胞凋亡，并用复元胶囊含药血清以及p38mapk的特异阻断剂sb203580干预. 透射电镜观察软骨细胞凋亡的超微结构，流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率的变化，比色法观察caspase3活性变化，免疫印迹技术（ nitroprusside，snp）诱导的软骨细胞凋亡信号传导过程中, p38 mapk信号通路参与了凋亡信号的转导［4］. 但 目前 国内外从信号转导的角度 研究 药物 治疗 骨关节炎的 文献 报道尚少. 复元汤是由晒参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子、三七等组成，是临床上长期用于治疗骨关节炎并有明显疗效的实验制剂. 本实验建立软骨细胞体外培养体系，观察复元胶囊含药血清对snp诱导的软骨细胞凋亡的影响，并从信号转导的角度探讨其作用机制. 　　1材料和方法 　　1.1材料雄性3 em=1∶1）培养基、优级胎牛血清（美国hyclone公司）；ⅱ型胶原酶（美国sigma公司）；胰蛋白酶（美国gibic公司）；总蛋白提取试剂盒（ 中国 升博生物公司）；p38mapk抑制剂sb203580（中国上海康成生物公司）；annexin vfitc试剂盒(中国晶美生物工程有限公司)；caspase3比色法检测试剂盒（美国bio vision公司）；磷酸化抗体p38(美国cell signaing公司)；p53抗体、蛋白内参βactin(美国santa cruz公司)；pbs缓冲液、辣根酶标记兔抗山羊igg（中国北京中衫生物技术有限公司）；免疫印迹化学发光试剂（中国碧云天生物公司）；pvdf膜（美国millipore公司）；spus公司）；7500型透射电镜（日本hitachi公司）；facs aria型流式细胞 分析 仪（美国bd公司）；凝胶成像仪（美国biorad公司）；elx800型酶标仪（德国gene公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1软骨细胞的分离、培养及传代参照文献［5］的方法， 将大鼠断颈处死后，无菌条件下分离股骨头，浸入含青霉素和链霉素的双抗水中漂洗3次， fd培养基中漂洗3次；将软骨剪成1 mm3大小，移入2.5 g/l胰蛋白酶中，37℃水浴箱中消化30 min；胎牛血清终止消化，pbs缓冲液清洗2遍；再加入2 g/l ⅱ型胶原酶，37℃水浴箱消化，每30 min轻轻摇荡1次，4 h后消化成絮状；1000 r/min离心5 min，弃上清，pbs缓冲液清洗2遍；加入含150 ml/l胎牛血清的fd培养基制成细胞悬液，用200目不锈钢筛网过滤后接种于培养瓶中，置于37℃,50 ml/l co2培养箱进行原代培养. 倒置显微镜下观察细胞长满80%后传代培养，ⅱ型胶原免疫细胞化学染色鉴定细胞. 　　1.2.2含药血清的制备〗雄性成年sd大鼠20只，随机分为复元胶囊组（10只）和对照组（10只）. 复元胶囊组按meehrubner氏［6］公式给予10倍等效剂量药物，充分溶于生理盐水后灌胃；对照组给予等体积的生理盐水灌胃，每日2次，连续3 d. 末次灌胃后2 h心脏取血，4℃静置过夜，3000 r/min离心20 min，取上清，经0.22 μm抽滤除菌后,分装,-20℃保存备用. 　　1.2.3实验分组实验分为正常组（含150 ml/l胎牛血清的fd培养基正常培养）、模型组（2 mmol/l snp+fd培养基）、空白血清组（2 mmol/l snp+含100 ml/l空白血清的fd培养基）、中药组（2 mmol/l snp+含100 ml/l复元胶囊含药血清的fd培养基）、抑制剂组（2 mmol/l snp+50 μmol/l sb203580+无血清的fd培养基，预先用sb203580孵育1 h，再加入snp和培养基）、中药+抑制剂组（2 mmol/l snp+50 μmol/l sb203580+含100 ml/l复元胶囊含药血清的fd培养基，预先用sb203580孵育1 h，再加入snp和培养基）. 　　1.2.4透射电镜形态观察将snp诱导的软骨细胞用2.5 g/l胰酶消化后进行收集，2000 r/min 4℃离心成细胞团块，用25 g/l的戊二醛固定2 h,10 g/l四氧化锇再固定1.5 h，经梯度丙酮脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片机切片， 电子 染色，hitachi7500型透射电镜下观察. 　　1.2.5流式细胞分析法检测细胞凋亡选用第2代软骨细胞，2×105个/ml密度种植于6