酶切与连接选编.pptVIP

酶切与连接; 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。 分两类： 1 核酸外切酶，从核酸链的一端逐个水解核甘酸的核酸酶。 2 核酸内切酶，能够水解核酸分子内磷酸二酯键的核酸酶。 ;一 核酸限制性内切酶与DNA分子的体外切割;限制修饰系统简称 R/M系统 restriction modification;2．Ⅱ型限制性内切酶的基本特性;例如，Hind Ⅲ切割结果形成5`单链突出的粘性末端；而Pst Ⅰ切割结果却形成3`单链突出的粘性末端。 （2）形成平末端 有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如HpaⅠ切割结果形成平末端。 Hind Ⅲ的识别序列是： HpaⅠ的识别序列是： 5`…A ↓ AGCT T…3` 5`…G ↓ TTAA C…3` 3`…T TCGA ↑ A…5` 3`…C AATT ↑ G…5`;（3）限制片断末端的连接作用 许多种限制酶切割DNA分子形成的短片断能够自发的重新环化起来。如果环化分子加热后又会重新线性化。但是，如果马上使用连接酶处理，使他们的3－OH基团和5—P基团之间封闭起来，环化就是永久的了。 连接分为：分子间连接和分子内连接。 ;;例如:BamHⅠ和Bgl Ⅱ; 相连后，其序列变为GGATCT CCTAGA， 与原来两个限制酶的识别序列均不相同，因此不再为原来的酶所切割。;3. 影响核酸限制性内切酶活性的因素; （1）DNA 纯度;（2）DNA甲基化的程度;(3 )酶切消化反应温度;（4） DNA的分子结构;（5 ）限制性内切酶的缓冲液;限制性内切酶的星号活性;二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接 ;1．DNA连接酶;机理： 1、ATP（NAD）与酶结合产生 E－AMP＋ppi 即E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi 大肠杆菌DNA连接酶，E(酶)＋NAD+→E－AMP ＋NMN（烟酰胺单核苷酸） ;2、E－AMP上的AMP转移到DNA的 5－PO4上使其活化 3、活化的5`－PO4与相邻的3`－OH作用形成3`－5`磷酸二酯键，并释放出AMP。但连接酶不能连接单链，必须要有模板的存在。也不能连接3`－OH和5`－PPP以及DNA与RNA。在后滞链的合成，DNA损伤的修复，重组及转座中DNA连接酶都发挥着重要的作用 ??? ; 影响连接效率的因素： A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值 E 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。;2．几种连接方式 ;A 用粘性末端DNA片断的连接;B 平端DNA片断的连接（1） 直接用T4ligase连接（2） 同聚物加尾法（3） 衔接物连接法;（1）直接用T4ligase连接;（2）同聚物加尾法;（3） 衔接物连接法