酶工程-04酶的分离纯化选编.ppt

第四章 酶的分离纯化; 纯化过程中注意的问题 1.注意防止酶的变性失活 一般要在低温下进行，要求特定的pH(pH4－10之间较稳定），不能有泡沫形成，消除重金属的作用和微生物污染等 2.可使用各种手段，但一定要达到目的 3.要有鉴定酶的适当方法。;第一节 酶活性测定;如果 每个酶分子中只有一个活性中心，酶浓度[E]即用mol表示，当有几个活性中心时，酶的浓度表示为 [E]mol=（酶的克数/酶的分子量）×活性中心数;三 比活力;化学法：利用化学反应使产物转变为一个可用某种物理方法或化学方法测出的化合物，再算出酶活性。 放射性化学法：用产物或底物具有放射性的性质，通过测定放射量的大小，算出酶活性。 （二）连续反应法 指在反应过程中用光学仪器连续检测反应进行情况，分为非偶联的和偶联的连续反应法 酶 反应 测定方法 LDH 乳酸＋NAD---丙酮酸＋NADH+H 340nmNADH增加 LDH 丙酮酸＋NADH+H---乳酸＋NAD 340nmNADH减少;偶联的连续反应法是加入指示酶。;五 酶活力测定中应注意的几个问题;V;第二节 酶溶液的制备;（一）物理破碎法;（二）化学法;二 抽提;（一）pH：.稳定性、抽提效果、纯度 （二）盐；.盐溶现象、盐析现象，一般采用稀盐溶液， 浓度在0.02－0.05mol/L （三）温度；考虑稳定性，通常控制在0－4℃左右，一般 不宜超过10℃ （四）抽提液用量：用量大提取率高，但酶浓度下降，不利于进一步纯化，一般为含酶原料体积的1－5倍，可一次提取，也可分几次提取。 （五）添加保护剂。;三 酶溶液的净化和脱色;四 浓缩;第三节 酶分离纯化的基本过程; 酶的分离纯化方法是依据酶和 杂蛋白在性质上的差异而建立起来的。 1.根据分子量设计的方法：离心法、凝胶过滤法。 2.根据溶解度大小：盐析法，有机溶剂沉淀法，选择性沉淀法，等电点沉淀法。 3.根据电荷的多少和性质：离子交换法，电泳法等。 4.根据稳定性差异；选择性热变性，选择性酸碱变性法。 5.根据亲和（互补）作用：亲和层析。;在实际工作中要考虑: 1.了解酶的理化性质 2.方法采用是否得当，以测定酶活为标???。 3.严格控制操作条件，防止酶变性失活。;二 酶分离纯化中的一些数据处理;总活力＝体积×活力 体积以毫升为单位 活力：Iu/ml 比活力＝纯度＝(活力/ml)/{蛋白（mg)/ml} 回收率（产量）＝（某步总活力/第一次抽提液的总活力）×100％ 纯化倍数＝某步纯化液比活力/第一次抽提液比活力;三 结晶; 过饱和时，溶液趋向一个平衡态，这时溶质在液相和固相之间分配，此时分子间的相互吸引作用大于相互分散或排斥作用，开始形成无定型的沉淀或结晶，对于溶液中的生物大分子来说，分子是处在含水的环境中，由于溶液的过饱和，维持水合物（完全隔离分子间的直接接触）所需的水是不足的，此时分子直接接触的机会增加，有可能形成无定型沉淀或结晶。如果溶液达到过饱和的过程太快，分子很快的聚集，往往出现无定型沉淀，这是应该避免的。如果溶液非常缓慢的达到过饱和点，分子就会有充分的可能排列到晶格中形成结晶。所以获得大分子结晶的基本方法有两方面，一是使体系非常缓慢地趋于最小溶解度状态，二是调整溶液性质和环境条件，使尽可能多的分子相互接近排列到晶格中。;（二）结晶条件;（三）结晶方法;X-ray Diffraction;X-ray Diffraction;Electron Density Maps;What to know about X-ray diffraction;１、单晶的概念及识别（晶体结构特征、几何外型特征、光学性质特征 ２、单晶分析样品的要求、选择和安装 上机的样品尽可能选择呈球形（粒状）的单晶体或晶体碎片，直径大小在0.1-0.7mm，无解理、无裂纹 确保用于单晶衍射的样品代表要鉴定的物相，从晶体的形状、颜色、解理和其他的分析方法给予保证。 ;四 酶的制剂与保存;第四节 根据分子大小轻重建立的 分离纯化方法;2.超滤 上世纪70年代以后，在实验室精制酶的过程中人们开始广泛采用超滤技术，进行大溶质分子的浓缩、分级分离、纯化等。其优点是操作简单、快速温和，操作中不产生相的变化，离子状态的变化以及温度变化。 此法主要是利用压力或离心力迫使溶质按分子量、性状大小